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                  細胞素信號為哺乳動物的組織模式提供了重要的貢獻

                  發布時間: 2024-01-11  點擊次數: 546次


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                  作者 埃里克·T.霍爾,Miriam E。
                      迪拉德,伊麗莎白R.克萊維登,...,
                      卡門辛德·羅賓遜,
                      杰弗里·斯坦伯格,史黛西K.奧格登

                   函件stacey.ogden@stjude.org

                   簡言之在神經管發育過程中,細胞素,特的信號傳導
                  絲狀偽足,有助于聲音刺猬和WNT的分散,以確保
                  適當的細胞命運的決定
                  通過腹側和背側的形態發生信號梯度。
                  派出
                  促進聲音刺猬的內吞循環,促進配體進入細胞素。

                   

                   

                   

                  亮點

                  .    發出的分裂促進了聲音刺猬的內吞作用

                  循環和胞質負載

                  .    細胞素有助于聲音刺猬的部署

                  神經發育過程中

                  .    肌凝蛋白10促進神經元細胞素的形成

                  SHH和WNT運輸

                  .    細胞素功能障礙會影響神經元細胞的命運

                  規格

                  細胞素信號提供了必要的信號

                  對哺乳動物組織模式的貢獻

                  埃里克T。過道1米里亞姆E。迪拉德1伊麗莎白·r·克萊弗頓1張燕1克里斯蒂娜·戴利,1Shariq S.安薩里,1

                  蘭德爾韋克菲爾德,2丹尼爾·斯圖爾特,1Shondra。普魯特米勒,1,3阿方索拉瓦多,1,4亞歷克斯·卡里西,1

                  阿曼達約翰遜,2永東王1艾瑪塞爾納,1邁克爾塔內斯,5楊桑雨,5卡門辛德·羅賓遜,2

                  杰弗里斯坦伯格,5還有斯泰西·k·奧格登1,6,*

                  1美國孟菲斯市圣猶大兒童研究醫院細胞和分子生物學系,TN 38105

                  2細胞成像共享資源,圣猶大兒童研究醫院,孟菲斯,TN 38105,美國

                  3高級基因組工程中心,圣猶大兒童研究醫院,孟菲斯,TN 38105,美國

                  4圣猶大兒童研究醫院兒童神經系統疾病研究中心,孟菲斯,TN 38105,美國

                  5體內成像和治療中心,圣猶大兒童研究醫院,孟菲斯,TN 38105,美國

                  6引線接觸

                  *Correspondence: stacey.ogden@stjude.org

                  https://doi.org/10.1016/j.單元.2023.12.003

                  總結

                  在發育過程中,形態因子通過指示細胞的命運來塑造組織。無法直接可視化形態轉運,因此確保形態成功傳遞的分子機制仍不清楚。為了解決這個長期存在的問題,我們開發了一個受損的聲音刺猬(SHH)形態發生傳遞的小鼠模型,并發現內吞循環促進SHH加載到被稱為細胞素的信號絲狀偽足中。我們優化了保存體內細胞素的方法,用于先進的顯微鏡觀察,并顯示內源性SHH定位于小鼠神經管發育過程中的細胞素。從神經管中消耗SHH會改變神經元細胞的命運并損害神經發育。絲狀狀體運動肌球蛋白10(MYO10)的突變降低了細胞素的長度和密度,從而破壞了SHH和WNT的神經元信號活性。這些結果表明,基于細胞素的信號轉運為哺乳動物組織發育過程中的形態發生分散提供了重要貢獻,并表明MYO10是細胞素功能的關鍵調控因子。

                  介紹

                  發育模式依賴于協調的細胞命運決定,這些決定由被稱為形態因子的信號蛋白指導。形態因子以時間和濃度依賴的方式發揮作用,通過信號梯度誘導不同的細胞命運,從而形成復雜的器官和組織。1,2這些梯度的改變會導致發育障礙和癌癥,這強調了在發育和組織穩態過程中精確控制形態發生者的分布的必要性。3

                  提出的形態發生子如何達到其目標的模型包括自由和輔助擴散,胞吞,以及通過稱為細胞素的特殊絲狀偽足直接傳遞。4實驗證據支持每一個分散過程,但控制這些運輸模式的分子機制尚未明確定義。在理解細胞素如何影響形態發生信號傳導方面的知識差距仍然非常大,因為技術上的挑戰往往阻礙了對體內結構的研究。

                  細胞素是一種長、薄、動態的細胞延伸,可以促進直接傳遞聲音刺猬(SHH)、WNT、骨形態發生蛋白(BMP)、生長因子和

                  在發育和組織穩態過程中的NOTCH配體。5–7關于細胞素生物學的大部分了解都源于人們對它們對果蠅翅盤、氣囊原基和卵母細胞組織和發育的貢獻的研究。8–10關于細胞素在脊椎動物發育過程中的功能的證據相對有限,但使用斑馬魚、小雞和美西螈模型的研究表明,細胞素影響原腸形成,并能促進四肢的發育和再生。11–13在脊椎動物神經管等復雜組織組織中詢問細胞素仍然不可行,因此限制了對這些結構何時何地活躍以及它們是如何被調節的理解。

                  為了深入了解這一重要的生物學特性,我們詢問了SHH形態發生信號通路。3,14,15SHH具有兩種共價脂質修飾,包括氨基端長鏈脂肪酸和羧基端膽固醇。這兩者都是SHH信號梯度的建立所必需的,也有助于調節補?。≒TCH)受體。16–19SHH脂質賦予成熟配體高的膜結合傾向,需要專門的機制來中和脂質系結,以便從產生的細胞中部署。這一機制的一個重要組成部分是12通道跨膜蛋白


                   

                  細胞187,1-18,2024年1月18日,ª,2023年,作者。.    1這是一篇在CC BY-NC-ND許可(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).下的開放獲取文章

                  已發送(DISP)。20–24DISP使用質膜Na+梯度驅動SHH膜提取轉移到細胞外擴散伴侶信號肽,CUB結構域和包含2的EGF樣結構域(SCUBE2)。25–29奇怪的是,對小鼠的遺傳學研究表明,SCUBE2在某些shh調控的發育過程中可能是需要的,30這表明存在獨立的、冗余的或協作的部署機制。因此,刺猬配體可以定位到從外泌體中的信號細胞中釋放出來的細胞素內的囊泡結構。31–36因為DISP定位于細胞素,36–38我們假設,除了促進SISP促進SCUBE2的輔助擴散外,還促進細胞素介導的SHH轉運。控制細胞素中DISP活性的調控機制尚不清楚。

                  我們之前證明了在DISP的第一個細胞外環中Furin的分裂是SHH部署所必需的。39結構分析顯示,雖然二硫鍵在剪切后保留了裂解片段,但DISP的處理對于打開其胞外結構域以實現SHH的釋放是必要的。28,29,40為了確定卵裂破壞如何影響SHH細胞素進入和形態梯度活性,我們建立了一個DISP加工受損的敲入小鼠模型(DISPCS).我們演示了DISPCS突變小鼠改變了神經模式、小腦功能障礙,以及由神經元細胞素的SHH消耗導致的高圍產期死亡率。通過肌動蛋白運動肌凝蛋白10(MYO10)的丟失來破壞細胞素功能,從而獲得了SHH信號通路的類似缺陷。36,41值得注意的是,有助于背側神經管模式的WNT信號通路,同樣因MYO10的丟失而減少。綜上所述,我們的研究結果支持了細胞素在哺乳動物組織形態發生過程中發揮重要作用,并確定了MYO10是細胞素功能的調節因子。

                   

                   

                  提示跳躍表型是Disp1中SHH信號減少的特異性表現CS/INDEL而不是由小腦功能障礙引起的一般共濟失調。

                  研究Disp1對組織模式的影響CS/INDEL通過SHH形態梯度,我們分析了E9.5/25-30體胚胎發育的神經管。開始…E8.0,來自脊索的SHH信號誘導神經管底板(FP),用叉頭盒A2(FOXA2)標記。SHH還指定了不同的腹側神經管祖細胞結構域,由NK2 Homeobox 2(NKX2.2)、少突膠質細胞轉錄因子2(OLIG2)和配對box 6(PAX6)標記。47這些腹側細胞命運的誘導對SHH暴露的波動高度敏感,因此祖細胞結構域的建立可以作為SHH形態發生梯度活性的讀數。48,49已發表的研究表明,具有雜合子Disp1突變的小鼠在表型上與野生型(WT)動物難以區分,而DISP活性的完全喪失會導致E9.5的死亡。21–23因此,演示1CS/+和顯示器1印第安納州/+胚胎表現為表型正常,具有典型的神經管祖細胞結構域建立(圖2A-2C、2F-2H和2K-2N)。相反,顯示器1英德爾缺乏功能性Disp1等位基因的突變體,在E9.5附近死亡,并出現神經管缺陷,包括PAX6的完全腹側化和FOXA2、NKX2.2和OLIG2祖細胞結構域的丟失(圖2D、2I和2K-2N)。顯示器1CS/INDEL.   神經管保留了足夠的SHH信號活性來誘導FP和NKX2.2和OLIG2祖結構域。然而,與對照組相比,這些結構域的大小縮小并向腹側移動(圖2J與圖2F、2K-2Q、S2A和S2A相比0).因此,RNAscope原位雜交分析顯示,在Disp1中表達Gli1的細胞數量減少CS/INDEL與對照組相比(圖2R-2W、S2B和S2C)。RNA測序(RNA-seq)分析證實,Disp1中的神經元分化受到損害CS/INDEL胚胎(圖S2D-S2G)。因此,在神經發育過程中,適當的SHH形態形成梯度活動需要適當的DISP裂解。

                   

                  結果

                  DISP的分裂是神經發育所必需的

                  CRISPR-Cas9用于生成Disp1基因細胞外環1中Furin切割位點突變的敲除小鼠(圖S1A)。39這導致產生了目標突變等位基因(Disp1CS)和一個敲除基因功能的11個堿基對缺失突變體(Disp1英德爾,圖S1A)。雜合子Disp1CS/+小鼠表型正常,而Disp1CS/CS突變體有不同的腦積水(圖S1B和S1C)。因此,演示1CS可能作為一個畸形等位基因,降低但不減弱DISP活性。因此,通過結合Disp1,進一步減少了Disp1基因的劑量CS和顯示器1英德爾反式的等位基因導致了高滲透率和嚴重的表型。大多數Disp1CS/INDEL幼崽在出生后1周內死亡,存活的動物會逃跑,無法茁壯成長(圖1A-1C和S1D)。存活下來的磁盤1CS/INDEL小鼠表現為腦積水,顱骨大小縮小,眶間距離縮小,頜骨縮短,小腦體積減少(圖1D-1F0和S1E-S1G0),表明在發育過程中SHH信號通路減少。42–44值得注意的是,97%的存活的Disp1CS/INDEL小鼠(n = 38/39)在6周齡時出現了跳躍性步態共濟失調(圖1G-1I0;視頻S1)。跳躍步態可能是由于shh指定的神經祖細胞的消耗,45,46sug-

                  DISP的內吞作用被分裂破壞而改變

                  在果蠅中,從極化的上皮細胞中部署Hh需要disp介導的內化和內吞循環。37,50為了測試DISP是否在哺乳動物細胞中發生了再循環,我們開發了一個體外系統來詢問DISP在極化、多細胞球狀體中的運輸。小鼠髓內收集管(IMCD3)細胞在3D培養中極化并可形成多細胞球狀體,51用編碼WT或CSV5-disp-血凝素(HA)蛋白和強力霉素誘導的SHH的載體轉導(圖3A-3G、S3A和S3A0).IMCD3細胞在Matrigel中培養,促進其組織成具有根尖腔的球狀體(圖3A-3E)。V5和HA表位標簽之間的信號重疊用于追蹤未切割的DISPCS和處理DISP重量其二硫鍵栓在氨基末端。28,29無SHH,DISP重量本地化更基礎,而DISPCS沿著細胞膜均勻分布(圖3a0和3c0).在強力霉素誘導后,SHH在根尖腔和細胞膜上積累,以及DISP重量

                  2細胞187,1-18,2024年1月18日


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                  圖1. DISP裂解中斷引發發育缺陷

                  (Aand B)男性和女性Disp1CS/INDEL小鼠體型縮小(n=5-17只小鼠/基因型)。P35雌性小鼠顯示在(A).中

                  (C) A Kaplan-Meier生存曲線顯示Disp1的生存能力降低CS/INDEL老鼠從P0到P35,每周監測16窩。

                  (D和E) Disp1CS/INDEL小鼠有腦積水和顱面缺陷。

                  (E)Disp1的計算機斷層掃描(CT)掃描CS/INDEL顱骨顯示寬長比擴大,眶間間距減少,頜骨長度減少(n=10-12只小鼠/基因型)。

                  (Fand F0) Disp1CS/INDEL小鼠的小腦也很?。ǚ嚼ㄌ枺?。在P0、P22和P55時計算小腦體積相對于總腦體積。每種基因型至少分析4只小鼠。

                  (G–I0) Disp1CS/INDEL老鼠的步態跳躍。(Hand I)前肢(藍色)和后肢(紅色)跟蹤肢體位置和量化步態比率。計算5只小鼠/基因型的步態比例,并合并雄性和雌性數據。所有數據均以平均± SD,*p < 0.05,**p < 0.01,****p < 0.0001表示。請參見圖S1和視頻S1。

                  沿著基底外側膜均勻富集(圖3b0、3F和3G)。磁盤CS在SHH誘導后,根尖基底分布沒有變化(圖3D0,3F和3G),表明Furin的切割啟動了shh刺激的極化上皮細胞的膜再分配。

                  為了確定shh刺激的DISP膜再分配發生的分子機制,我們在Disp1中穩定表達了V5-DISP-HA蛋白-/-分配)小鼠胚胎成纖維細胞(mef)。這就允許對DISP進行檢查

                  在沒有內源性的背景下的膜運輸

                  可能影響DISP的DISP蛋白CS循環通過

                  低聚物關聯。39,52細胞表面生物素化和環素化

                  己酰亞胺處理實驗證實了DISP重量

                  磁盤CS蛋白質具有相似的細胞表面表達和

                  降解動力學,表明裂解破壞有

                  不顯著降低DISP蛋白的穩定性或限制其mem-

                  膜訪問(圖S3B、S3C0和S3N)。探測SHH-

                  誘導DISP膜循環的變化,我們進行了


                   

                  細胞187,1-18,2024年1月18日3


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                  圖2。DISP卵裂破壞改變了神經管模式

                  (A-E)指示基因型的E9.5/27-29體細胞胚胎顯示。

                  (F-J)對E9.5/27-29體細胞胚胎發育中的神經管的心臟水平切片進行FP和腹側祖細胞標記物的染色。DAPI標記核。星號表示FOXA2在脊索和前腸中的表達(I)。

                   

                  (下頁繼續圖例)

                  4細胞187,1-18,2024年1月18日


                  免疫熒光共定位分析并計算DISP與內吞標記蛋白適配器蛋白2a(AP2)、網格蛋白、洞穴蛋白、Rab4、Rab5、Rab7和Rab11之間的Pearson相關系數(圖3H和3H0).53而DISP重量和DISPCS在沒有SHH的情況下,蛋白表現出與AP2相似的共定位水平,而SHH的表達存在差異。在表達SHH的細胞中,DISP重量與AP2的共定位增加,而DISP則增加CS-AP2的共定位保持不變(圖3H0和S3D-S3G)。在DISP之間也觀察到shh誘導的共定位增加重量以及網格蛋白、Rab4、Rab5、Rab7和Rab11(圖3H0和S3H-S3M),表明DISP重量與SHH的相互作用增強了內吞循環。磁盤CS循環核內體的富集對配體的反應沒有增加。然而,它比DISP略豐富重量在沒有SHH的情況下,腸黃素、Rab5、Rab7和Rab11標記的內吞室(圖3H0和S3H-S3M)。

                  DISP與洞穴蛋白的共定位均未被切割位點突變或SHH的表達所改變,這表明網格蛋白介導的內吞作用是SHH刺激的DISP內吞循環的主要途徑(圖3H0).因此,我們在DISP的胞內羧基端尾部確定了AP2網格蛋白適配器復合物的四個推測的雙亮氨酸結合基序(圖3I)。為了確定這些基序是否有助于shh刺激的再循環,我們生成了一個缺失所有四個基序的羧基末端缺失突變體(DISPΔC)和一個將這四個基序突變為丙氨酸的突變體(DISP4xAA).兩個DISPΔC和DISP4xAA到達細胞表面,并被Furin有效地處理,這可以通過細胞表面的生物素化和V5裂解片段的產生來證明(圖S3N)。重要的是,ΔC和4xAA突變體在生物素化質膜組分中均表現出高于DISP的富集重量和DISPCS,與促進DISP內吞作用的ap2結合位點一致(圖S3N)。磁盤ΔC質膜富集比DISP更明顯4xAA,表明羧基末端片段中的一個額外的基序可能有助于膜的內化。因此,我們專注于DISPΔC為進一步分析??赡苁怯捎谠贒ISP之間觀察到的基線共定位適度升高CS和內吞機制,DISPCS其細胞表面定位率低于DISP重量(圖3H0和S3N)。

                  為了進一步探索這一機制,我們檢測了Furin的切割是否影響了DISP-AP2的結合。V5-DISP-HA蛋白在表達shh的Disp中表達我們進行了mef實驗和共免疫共沉淀實驗。與DISP通過網格蛋白/ap2依賴的機制內化相一致,a和β-適配蛋白蛋白均存在于與DISP的抗ha共免疫沉淀中重量(圖3J,第5車道)。第2頁

                  在兩個V5-DISP中的適配器亞基都減少了CS-HA和V5DISPΔC-HA共免疫沉淀(圖3J,6-7通道),支持DISP通過一個或多個已鑒定的羧基末端結合基序結合sAP2,Furin切割在SHH結合后通過這些位點增強DISP-AP2的結合。

                  來檢測減少的AP2結合是否改變了DISPCS或DISPΔC內化動力學上,我們用光穩定熒光標記Dronpa3標記WT和突變體DISP蛋白54并追蹤Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞的基線和shh刺激的內化。52,55為了準確地跟蹤膜的內化,我們首先使用網格蛋白抑制劑Pitstop 2暫停內吞作用,56然后監測Pitstop 2洗脫前后的DISP-Dronpa3質膜信號強度(圖3K-3L0).與網格蛋白是DISP內化的主要途徑相一致的是,所有的DISP變體在Pitstop 2的作用下都在質膜上積累(圖3K和3L)。Pitstop 2洗脫后,三種DISP蛋白的膜信號強度均下降,但它們的內化率差異明顯(圖3K0和3l0).根據在DISP之間觀察到的適度升高的共定位CS而內吞標記物對SHH的反應沒有改變(圖3H0), DISPCS在配體缺失和存在的情況下,以恒定的速率內化。相反,SHH的表達加速了DISP重量內部化的速度比DISP更快CS(圖3K0),進一步表明WT蛋白經歷了配體刺激的內吞作用。磁盤ΔC內化的速度比DISP要慢重量在SHH的缺失和存在的情況下,證實了羧基端ap2結合基序是DISP有效內吞作用所必需的(圖3L0).結合以上實驗,這些結果表明,DISP膜的循環是通過網格蛋白介導的內吞作用發生的,而Furin的切割增強了DISP對SHH的反應,以及配體刺激的循環內吞作用(圖3M)。

                  DISP突變減少了SHH細胞素的進入

                  對果蠅和脊椎動物的研究表明,Hh配體從外囊泡中產生的細胞中釋放出來,我們實驗室之前的工作表明,SHH和DISP定位于細胞素內的囊泡。31–33,35,36因此,我們推測DISP-SHH復合物的內吞循環可能促進SHH囊泡富集以促進細胞素進入。檢測DISP的內吞循環活性CS改變了細胞素中SHH的數量,我們在Disp中穩定表達了WT或CS V5-DISPHA蛋白mef,然后定量細胞素發生率和SHH和DISP細胞素進入(圖4)。我們之前證明了SHH共受體的兄弟


                  (=-n)每個基因型分析的n3個3-5個胚胎的神經管切片中所示的祖細胞標記物的平均表達域區域(黑點)?;疑狞c代表單獨的部分。

                  (O和P)以OLIG2 (O)和NKX2.2 (P)沿背側/腹側(DV)軸的平均熒光強度線圖顯示。從FP中線基面到屋頂的線形圖(虛線,插入O)。虛線表示掃描電鏡。n=14-18個切片。

                  (Q)指示的DV位置相對于神經管長度的箱線圖。腹側和背側區域的位置分別顯示在盒子的頂部和底部。n = 3個胚胎,每個胚胎有5-8個切片。FP中線被設置為零。

                  (R-V)RNAScopeGli1原位雜交在E9.5/25-30體細胞期匹配的心臟水平的神經管切片上。Gli1探針為紅色,DAPI為藍色。

                  (W)從FP到屋頂板的平均Gli1信號強度圖。每個基因型有3個胚胎,每個基因型定量n個=26-30個切片。虛線表示半散點,箱線圖數據表示為平均± SD,**p < 0.01,****<0.01,****p < 0.0001,ns =不顯著,見圖S2。. .

                   

                  細胞187,1-18,2024年1月18日5


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                  圖3。DISP的裂解促進了shh刺激的內吞循環

                  (A–D0) IMCD3球狀體穩定表達DISP重量或DISPCS蛋白質用抗v5(洋紅色)和抗ha(綠色)進行免疫染色。F-actin在(A)和(C)中為黃色(強力霉素陰性),強力霉素誘導的SHH在(B)和(D).中為黃色DAPI是藍色的??s放區域用虛線表示。箭頭表示(F)和(G)分析的區域。

                  (下頁繼續圖例)

                  6細胞187,1-18,2024年1月18日


                   

                  CDON(BOC)和細胞粘附分子相關/被致癌基因(CDON下調)促進shh產生細胞中細胞素的發生,而在培養的小鼠成纖維細胞中細胞素的形成不需要DISP。36因此,SHH的表達增加了細胞素的發生率,而不依賴于DISP(圖4A)。盡管它能夠促進Disp中細胞素的發生SHH不能有效地進入缺乏DISP蛋白的細胞素,也不能激活與SHHDisp共培養的SHH光II膠熒光素酶報告細胞的信號mef(圖4B、4E和S3O)。DISP蛋白在DISP中的表達mef顯示DISP重量和DISPCS以相似的效率進入細胞素。盡管如此,只有DISP重量顯著增加SHH細胞素進入,盡管水平略低于WT細胞中觀察到的水平(圖4B-4G0).類似地,DISP重量在SHH光II細胞共培養實驗中,SHH產生細胞中表達比DISP表現出更高的信號活性CS(圖S3O)。因此,配體刺激的DISP-SHH復合物的內吞循環可能有助于SHH包裝成囊泡,用于細胞素裝載和/或信號轉導。

                  進一步評估SHH細胞素進入DISP的影響CS在接收細胞(RCs)中表達通路誘導的信號產生細胞,我們監測了shh激活的Ca2+不斷的變動36分配單獨表達SHH或與WT或CS DISP蛋白共同表達的mef與Ca共培養2+在細胞素接觸的報告細胞中定量報告細胞和通量率。加拿大2+通量率與SHH細胞素加載狀態相關,如DISP重量-表達細胞誘導的通量率明顯高于Disp或DISPCS表達細胞(圖4H)。因此,DISPCS突變破壞了shh刺激的DISP內吞循環,減弱了其伴隨SHH進入細胞素的能力,從而促進接觸介導的信號傳導。

                   

                  含shh的細胞膜存在于

                  神經管

                  我們開發了組織處理、固定和成像策略,以便在發育中保存和檢測細胞素。57使用這些方法,我們從產生shh的NCs和神經管FPs中尋找細胞素樣延伸。一種番茄膜

                  使用brane-GFP(mT/mG)報告基因用GFP標記表達shh的細胞膜。58,59共聚焦顯微鏡觀察E9.5/25-30體胚胎的心臟水平切片顯示GFP陽性膜延伸從FP細胞向鄰近的非GFP表達的細胞延伸。在分析的88%的組織切片中觀察到這些延伸(圖5A,箭頭)。GFP陽性的FP延伸也穿過神經管腔(NTL),接觸鄰近的非GFP標記細胞(圖5B和5B0).平均,……觀察到11個管腔延伸,表明發育中的神經管中產生shh的細胞可以直接接觸靶細胞群。

                  為了確定神經管延伸是否為細胞素,我們檢測了SHH和肌動蛋白的定位。我們使用Shh在神經管切片中驗證了抗Shh抗體染色GFP從內源性SHH啟動子中產生一個內部gfp標記的、脂質修飾的SHH蛋白的敲入等位基因。60什赫+/+, ShhGFP/+, ShhGFP/GFP胚胎用抗GFP和抗shh染色,然后用共聚焦顯微鏡分析。而Shh+/+胚胎中抗GFP和抗Shh信號之間的共定位可以忽略不計,NC和FP的信號重疊隨著Shh的增加而增加GFP等位基因合子性(圖S4A-S4C)。由于SHH抗體在固定組織樣本中檢測SHH蛋白具有足夠的敏感性,我們通過WT胚胎的全貼裝免疫染色檢測fp衍生的延伸是否包含內源性SHH和actin(圖5C)。檢測到含有SHH斑點的肌動蛋白陽性延伸從FP延伸到NTL,表明在Shh-Cre;Rosa26的NTL中觀察到GFP標記的膜延伸mT/mG胚胎很可能是細胞素(圖5B-5C0).

                  為了研究神經管細胞素的運動軌跡,采用掃描電鏡(SEM)進行雙向觀察切片E9.5 Disp1+/+, Disp1印第安納州/+和Disp1英德爾em-通過處理來暴露NC、FP和NTL內襯細胞的頂端表面(圖5D和S4D)。在對照組和Disp1中,觀察到長而薄的細胞延伸穿過腔內細胞的頂端膜,并接觸相鄰細胞的頂端初級纖毛英德爾


                  (E)IMCD3球體模型顯示了(F)中的分布曲線和頂端/基礎熒光強度比(G)的分析區域。

                  (F)顯示了V5-DISP-HA從基底膜到根尖膜的平均熒光強度分布曲線。數據歸一化為平均分布強度等于1,點代表細胞±SEM(n=21-29個細胞)分布的平均強度。實線表示整個細胞內熒光強度的綜合曲線。

                  (G)DISP中HA、V5和SHH的平均熒光強度比±SD(根尖/基礎)重量或DISPCS顯示表達球形細胞(每個條件下n=40-47個細胞)。

                  (H)網格蛋白和小泡蛋白內吞途徑的匯總圖。

                  (H0)DISP-HA與Disp中內吞體標記物共定位的皮爾遜相關系數值穩定表達V5-DISP的mef重量-HA或V5-DISPCS-HA在SHH-mCherry(n=23-39細胞)或空載體對照(n=60-126細胞)的存在下。數據以帶有1的中位數(實線)表示st和3rd四分位數(虛線)。

                  (I)V5-DISP-HA蛋白的示意圖,其候選雙亮氨酸ap2結合基序和羧基末端缺失消除了這些位點。

                  (J)從Disp的膜組分中提取DISP-HA的免疫共沉淀mef穩定表達SHH與V5-DISP-HA蛋白穩定表達SHH或網格蛋白適配器亞基的GFP對照蛋白印跡。

                  (K–L0)在Pitstop 2(K和L)和洗脫后的MDCK細胞單層中表達的DISP-Dronpa3蛋白(K0和L0).細胞共同表達膜-mCherry(對照)或SHH-mCherry。n=-3次實驗,每個條件下分析31-54個細胞。數據以平均± 95%置信區間表示。

                  (M)一個用于DISP內部化的模型。通過Furin裂解DISP促進shh誘導的構象轉移,從而增強DISP-AP2結合網格蛋白介導的SHH-DISP復合物的內吞作用。裂解破壞改變了DISP的構象,以提高基礎內化和減弱shh刺激的內化。在所有實驗中,**<0.05,***p<0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001,ns =無顯著性。見圖S3。

                   

                  細胞187,1-18,2024年1月18日7

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                  圖4。DISP的裂解促進了SHH細胞素的進入和信號轉導

                  顯示(A)細胞素發生率mef通過GFP對照(淺灰色)或SHH-GFP(深灰色)穩定表達指示的DISP蛋白。(B-D)Disp的共焦圖像表達SHH-GFP的mef(綠色),穩定表達V5-DISP重量-HA (C,洋紅色)或V5-DISPCS-HA (D,洋紅色)如圖所示??s放圖像顯示了在上面的面板上概述的區域。

                  (E和F)散點圖顯示了平均SHH-GFP (E)或DISP (F)細胞素/細胞體信號強度比值。

                  (G和G0)V5-DISP中每個細胞素的SHH-GFP與DISP-HA的相對強度的線性回歸模型重量-HA或V5-DISPCS-HA表達Dispmef。

                  (H) NIH-3T3細胞表達R-GECO Ca2+報告基因與對照或表達Disp的Disp共培養細胞顯示。從n個=31-41個與產生SHH-GFP的細胞素接觸的單個細胞中計算每分鐘的通量率控制或DISP重量/DISPCS表達mef。數據以平均±標準差表示。對于所有圖表,顯著性表示為**<0.05,**p < 0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001,ns =不顯著。

                   

                  胚胎(圖5E-5H)。大約50%的根尖初級纖毛通過獨立于DISP狀態的延伸進行接觸,表明這些關聯具有功能意義(圖5H和5I)。雖然大多數細胞連接與NTL細胞的頂端膜接觸,但也觀察到連接提示了與果蠅類似的形態發生突觸61(圖5F,綠色圓圈)。由于神經管的復雜結構,很難識別大多數延伸的起源。然而,在細胞-細胞接觸的部位,延伸經常出現進入管腔(圖S4E,綠色箭頭)。因此,來自腹側FP細胞的延伸可以被追蹤到NTL,這表明它們可能在細胞-細胞連接之間傳遞(圖S4F和S4G,綠色箭頭)。與體外實驗表明DISP不需要細胞素形成一致,在所有檢測的基因型中,神經管延伸具有相似的頂端暴露長度和發生率(圖5G和S4H)。值得注意的是,所有基因型的細胞延伸都顯示出沿其長度的突起

                   

                  代表囊泡性貨物(圖S4F和S4G,黃色箭頭),如之前報道的果蠅和小鼠細胞培養。36,62

                  基于細胞素的根尖SHH傳遞

                  初級纖毛作為信號樞紐,富含SHH通路成分,包括受體PTCH、信號傳感器平滑(SMO)和膠質瘤相關癌基因(GLI)轉錄效應因子。63,64因此,SHH頂端細胞向初級纖毛是一種快速激活通路的有效機制。因為腹側神經管祖細胞結構域的SHH規范發生在E8.5–E9.0/8-20體細胞之間,47用共聚焦顯微鏡觀察17-20體期的WT胚胎,以檢測NTL內襯細胞的初級纖毛附近的SHH。我們在管腔內觀察到SHH,它經常與arl13b標記的初級纖毛共定位(圖5J,箭頭)。值得注意的是,在相鄰細胞群中,46%(n = 39/84)的肌動蛋白陽性延伸與arl13b標記的頂端初級纖毛接觸,其中含有SHH(圖5K-5K00和S4I-S4J00;視頻S2和S3)。這些


                   

                  1-18,2024年1月18日


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                  圖5。SHH定位于發育中的神經管中的細胞素

                  (A–B0神經管顯示E9.5/25-30 E9.5/25-Rosa26mT/mG晶胚在17個胚胎的69/78切片掃描中檢測到來自表達shh細胞的(A)GFP標記細胞延伸。(波段B0)GFP陽性膜延伸從FP穿過神經管腔接觸鄰近細胞(插圖顯示縮?。?。

                  (C–C0)一個3D渲染顯示了從一個Disp1的神經管FP的延伸+/+E9.5胚胎F-actin染色(C陰影,C白色0)和抗shh(白色,箭頭在C,洋紅色為C0).圖中呈現的區域由神經管示意圖中的虛線框表示。每個組織切片平均觀察到11個神經管腔延伸,如(B)和(C)。n = 976個擴展得分橫跨32個胚胎。

                  (D)矢狀平分胚胎示意圖,顯示神經管腔(NTL)、FP和脊索(NC)根尖部的表面位置。

                  (EandF)E9.5(E)Disp1的SEM圖像印第安納州/+(F) Disp1英德爾NTL。頂端延伸(洋紅色)接觸初級纖毛(箭頭,藍色)或使細胞尖接觸(虛線圈)。

                  (G)NTL頂端延伸段長度的散點圖。每個基因型檢測3個胚胎。共61個(Disp1印第安納州/+)和68(演示1英德爾)擴展被測量。

                  (H)每次掃描中觀察到的接觸細胞延伸的纖毛的百分比。用n = 344 Disp1對每個基因型進行4-11次掃描分析+/+, n = 684 Disp1印第安納州/+,和n = 756 Disp1英德爾纖毛接觸者得分。Ns,不重要。

                  (H0)小提琴圖顯示了所有基因型中與初級纖毛接觸和與初級纖毛接觸的纖毛的比例。n=1784個初級纖毛和總延長39070分。數據以帶有1的中位數(實線)表示st和3rd四分位數(虛線)。

                  (一)纖毛與延伸接觸處的代表性圖像。接觸延伸的纖毛呈粉紅色,不接觸延伸的纖毛呈藍色。

                  (J) E9.0/17–20 somite Disp1+/+神經管免疫染色為ARL13B(綠色)和SHH(洋紅色)。箭頭表示在初級纖毛附近的SHH斑點。n = 10個胚胎。

                   

                   

                  (下頁繼續圖例)

                  第187,1-18號細胞,2024 9年1月18日

                  結果與之前的報告顯示SHH一致,60這表明細胞素可以直接將SHH傳遞給纖毛PTCH受體。

                  為了檢測FP內表達SHH的細胞的細胞素樣延伸是否可以進入神經管將SHH傳遞到根尖腔,我們對對照和DISP突變E9.5胚胎的神經管進行了一系列阻斷faceSEM(SBFSEM)(圖5L、5M和S4K-S4M)。在所有基因型的測試中,單個片段的細胞之間存在多個膜性“水泡”(圖5L,S4K0和S4L0).當通過連續掃描映射生成體積三維重建時,氣泡連接起來,顯示出指向管腔的長時間連續延伸(圖5M和S4M;視頻S4)。雖然FP中的高細胞密度阻止了我們將這些延伸映射到管腔內,但在矢狀神經管切片的共聚焦和掃描電鏡圖像中觀察到的細胞素的大小和軌跡相似,表明它們是相似的結構(圖5A-5C0箭頭、S4F和S4G黑色箭頭)。因此,我們建議細胞素穿過腹側神經管,以促進SHH傳遞到根尖腔。

                   

                  DISP增加了SHH進入神經元細胞素

                  來自NC的SHH對于FP的誘導、向體細胞傳遞信號以及周圍間充質的組織至關重要。65–69因此,NC和周圍組織的掃描電鏡顯示,在對照組和DISP突變體胚胎中,NC、FP和間充質細胞的膜延伸之間存在相互作用(圖6A、6C-6E、S5A和S5B;視頻S5)。E8.5 Shh-Cre的共聚焦成像;Rosa26mT/mG和E9.5 ShhGFP/+胚胎證實了其延伸為SHH、F-actin和GFP陽性,表明它們是細胞素(圖6B-6B00和S5C-S5C”)。值得注意的是,E8.5 Shh-Cre;羅莎26mT/mG胚胎顯示GFP標記的NC延伸到shh反應的體69(圖S5C-S5C)。這些結果表明,擴展可能促進NC和周圍細胞群之間的通信。

                  為了確定SHH定位到nc衍生的細胞素是否需要DISP,SHHGFP引入對照和Disp1突變背景,用共聚焦顯微鏡檢測NC到FP的連接。在所有檢測的基因型中,從NC到FP和間充質的多個f放線陽性延伸(圖S5D-S5G)。值得注意的是,SHH存在于對照組胚胎的NC、FP和間充質之間的細胞素中,但在Disp1的細胞素中耗盡英德爾和顯示器1CS/INDEL胚胎(圖6F-6L)。我們量化了每個nc衍生的細胞中SHH斑點的數量E9.5 Disp1中的線束印第安納州/+, Disp1英德爾和Disp1CS/INDEL胚胎同時使用手動和自動化的方法。我們發現,DISP突變基因型的細胞膜中SHH斑點明顯少于對照胚胎細胞素(圖6J-6L、S5H和S5I)。與這些連接相一致的是必要的-

                   

                  通過nc衍生的SHH誘導FP信號轉導,Disp1的FPs中SHH蛋白水平顯著降低英德爾胚胎(圖6H和6I)。在對照組和Disp1中沿FP細胞基膜檢測到脊索來源的SHH英德爾突變胚胎,表明當細胞素基運輸受損時,基礎信號仍然可以積累(圖6H和6I,箭頭)。盡管有這種積累,但在缺乏DISP活性的胚胎中,在FP中沒有檢測到SHH,這表明基礎膜配體的積累不足以強大地誘導高閾值靶基因?;谖覀兊捏w外和體內結果,我們提出DISP促進SHH的內吞循環,將配體加載到細胞素中,進行頂端形態傳遞,這有助于神經管模式(圖6M)。

                   

                  MYO10促進細胞素信號傳導

                  肌動蛋白運動MYO10促進絲狀蛋白的形成,我們的體外研究表明,它有助于培養細胞中細胞素介導的shh運輸。36,41,70因此,我們之前證明了MYO10在體內的缺失會破壞發育中的神經管中的SHH信號。36為了探究這種表型是否源于細胞素形成的改變,我們使用了我們的細胞素優化的組織處理方案來可視化Myo10中的細胞素m1J/m1J老鼠71我們首先分析了E8.5胚胎,其中SHH在NC中的表達明顯高于在FP中。60在這一階段,膜GFP(memGFP)信號被限制在E8.5 Shh-Cre;Rosa26mTmG胚胎(圖7A,7B0,7E和7F)。雖然在對照胚胎的NC上可見大量的延伸,但在Myo10的NC上檢測到的延伸很少m1J/m1J胚胎(圖7a-7b0),表明肌動蛋白運動在其形成過程中的作用。

                  量化對照組和Myo10中神經管延伸的長度和發生率m1J/m1J利用貓女軟件對E9.5胚胎的SBF-SEM數據集進行了注釋。72這表明Myo10m1J/m1J與對照組相比,神經管的延伸更少,現有延伸的平均長度相對較短(圖7C、7D和S6A-S6E;視頻S6)。這種缺失與Olig2表達模式的改變相關,從Myo10的完全缺失到Olig2明顯的腹側移位m1J/m1JE8.5/10-13個體細胞胚胎(圖7A0對抗7B0和7e-7g)。這種轉變表明了高水平SHH信號通路的減少,這通常限制了Olig2從直接鄰近FP的細胞中發出。47,73在Disp1中也觀察到類似的Olig2表達模式的改變CS/INDEL在E8.5/10-13體細胞上的胚胎,支持了類似的功能缺陷是由降低細胞素密度(Myo10m1J/m1J)或消耗其SHH(Disp1CS/INDEL)(圖S6F-S6H)。這與myo10促進的細胞素在腹側細胞命運決定的早期階段促進SHH運輸相一致,


                  (K–K00)一個Disp1的三維渲染+/+腹側神經管有兩個方向。一個來自FP的F-actin(白色)標記的延伸(黃色箭頭)和SHH(洋紅色)與接收細胞(RC,藍色箭頭)標記的ARL13B(綠色)接觸。黃色虛線表示FP和RC的劃分。所渲染的區域由虛線框表示。

                  (L)E9.5Disp1的單個SBF-SEM部分+/+神經管FP顯示細胞間間隙,包含孤立的水泡(藍色,inseti)和部分延伸(插圖ii)。(M)三維重建的兩個細胞的膜延伸。散點圖用平均±標準差表示。請參見圖S4和視頻S3和S4。

                   

                  10細胞187,1-18,2024年1月18日


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                  E8.5 Myo10的NTL耗盡了SHH信號m1J/m1J胚胎(圖7e00與圖7F相比00,7H和7I)。因此,我們認為MYO10是體內細胞素功能和SHH信號通路的重要調節因子。

                  在背側神經管模式形成過程中,WNT和bmp在頂板上產生信號,與NC和fp衍生的SHH相反。74–76與之前的報道一致,即WNT和BMP家族成員都沿著細胞素運輸,13,77我們觀察到肌動蛋白陽性延伸從頂板延伸到背側NTL(圖S6I)。為了探究背側細胞素是否有助于WNT和/或BMP在神經管中的運輸,我們首先進行了體外細胞素發生試驗,以確定MYO10是否影響WNT或BMP細胞素的形成。我們量化了對照組和Myo10中的細胞素發生率-/-在沒有或存在SHH-GFP、BMP2-GFP、bmp4-橙色熒光蛋白(OFP)、BMP7-GFP和WNT1-GFP時的mef。36而BMP2、BMP4或BMP7熒光蛋白的表達并沒有顯著改變細胞素的發生率,而SHH-GFP和WNT1-GFP在WTmef中均有所增加,其發生率具有統計學意義(圖S6J,淺灰色)。SHH-GFP和WNT1GFP均未增加Myo10中細胞素的發生-/-除了促進SHH細胞素的形成外,MYO10也是WNT細胞素形成的調節因子(圖S6J,深灰色)。

                  評估MYO10缺失對體內、對照組和MYO10神經管WNT信號的影響m1J/m1J檢測E9.5/25-30體細胞胚胎,以評估WNT靶點Olig3的表達。MYO10缺失降低了OLIG3的背側表達域(圖7J-7M)。與體外實驗結果一致,MYO10的缺失不影響bmp表達細胞的細胞素,bmp誘導的磷酸化SMAD(pSMAD)的背側富集不受影響m1J/m1J神經管(圖7N-7Q和S6J)。值得注意的是,E8.5 Myo10的RNA-seq分析+/+和Myo10m1J/m1J胚胎實驗結果顯示,在MYO10缺失后,SHH和WNT通路均被減弱,而BMP信號通路沒有明顯改變(圖S7)。有趣的是,NOTCH信號可以通過環境依賴的細胞素運輸發生,7在Myo10中也被確定為減少了嗎m1J/m1J胚胎(圖S7D和S7D00).綜上所述,這些結果表明

                   

                  MYO10是細胞素功能的一般調節因子,除了基于擴散的信號分散機制外,基于細胞素的轉運有助于WNT和SHH介導的神經管發育模式。

                  討論

                  DISP的裂解促進了shh刺激的內吞作用

                  再循環

                  自從我們最初的報告強調了DISP裂解對SHH部署的重要性以來,多個DISP結構已經被解決。28,29,39,40,78結構證據表明,裂解片段仍然緊密相連,但剪切打開了DISP的胞外結構域,以適應SHH的結合。28,29,40,78我們新的細胞生物學實驗表明,DISP的裂解增強了對shh刺激的ap2依賴的內吞循環的反應性。因此,我們認為DISP的切割穩定了一種蛋白質的構象,該構象轉向“打開”的細胞內尾巴,以便在SHH結合時與AP2緊密結合(圖3M)。我們推測Furin的裂解破壞改變了DISP的構象,使它與AP2以中間親和力相互作用,以構成中層內吞循環。因為DISP的胞內結構域不能解決無脊椎動物的DISP低溫電子顯微鏡(cryo-EM)結構,28,29,40我們不能明確地得出結論,SHH誘導構象變化,從而影響ap2結合位點。然而,細胞生物學分析揭示了DISP之間的一個關鍵的功能差異重量和DISPCS蛋白質是DISP的能力重量在信號產生的細胞中通過SHH進行增強的再循環。

                  細胞素在神經管過程中運輸形態因子

                  圖案裝飾

                  在小鼠中,nc衍生的dSHH信號到腹側神經管,在E8.0左右開始指示腹側命運。通過E9.5,Shh在FP中被誘導表達,FP在NC開始回歸后作為神經管Shh的次要來源。60大多數腹側命運是由E8.5確定的,這表明初始模式信息是通過nc衍生的信號傳遞的。60,66然而,脂質修飾的SHH從NC、后經FP、andintotheapicalneuraltubehaveremainedundefined.優化的組織處理和成像的發展


                   

                   

                  圖6。含shh的細胞素連接脊索、神經管FP和周圍的間充質

                  E9.5 Disp1的(A)掃描電鏡印第安納州/+胚胎顯示脊索(NC)和間充質。nc衍生的延伸(洋紅色)延伸到間充質細胞的延伸(藍色)。

                  (B–B00) E9.5 ShhGFP/+;Disp1印第安納州/+胚胎染色為SHH(洋紅)、f-actin(綠色)和DAPI(藍色)。SHH點(B0在f-actin陽性(B00)在間充質和NC之間的延伸。頂部為FP,左側為間充質細胞,右側為NC。

                  (C-E)單個NC細胞(藍色)的三維體積渲染,與間充質細胞(黃色)的延伸接觸延伸。同樣的細胞會延伸到神經管FP的基面(D中顯示的單個切片,E中顯示的3D體積渲染)。參見圖S5A和S5B和視頻S5。

                  (F–G0)對來自上述基因型的E9.5/27-29體細胞胚胎進行抗GFP(綠色)、抗shh(洋紅色)和DAPI(藍色)的免疫染色。在NC和FP (F0和G0,黃色箭頭)。

                  (H)來自NC(箭頭)的抗Shh陽性延伸物接觸到Shh中表達Shh的神經管FP邊緣附近的細胞基底表面GFP/+; Disp1印第安納州/+E9.5胚胎。

                  (I)沿著a Shh的基面檢測到SHH信號GFP/+;Disp1英德爾神經管(箭頭),但FP中的信號減少。

                  (Jand K)抗Shh斑點(洋紅色,箭頭)在Shh中NC和FP之間的F-actin陽性(綠色)延伸上GFP/+;Disp1印第安納州/+胚胎(J)。在SHH中,NC和FP之間的連接中很少有明顯的SHH斑點GFP/+;Disp1英德爾胚胎(K)。

                  (L)對Shh的脊索-fp細胞素中平均抗Shh斑點面積的散點圖GFP/+;Disp1印第安納州/+, Disp1CS/INDEL和Disp1英德爾胚胎切片。每個基因型至少有2個胚胎,每個基因型有9-15個切片。數據以平均±標準差表示。**p <為0.01,ns,不顯著。(M)內吞作用如何促進DISP-SHH進入細胞素的模型。WT和裂解缺陷的DISP蛋白都能進入細胞素,但只有WT的DISP能有效地將SHH轉運到細胞素中。見圖S5。

                   

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                  圖7.肌球蛋白10促進體內細胞素形成和SHH和WNT信號傳導

                  (A–B0)腹側神經管和深度陰影鼻弦延伸(箭頭)從E8.5/10體SHH-Cre;Rosa26mT/mGMyo10+/+(A和A0)和Myo10m1J/m1J(B波段0. 胚胎的和弦是綠色的0)和(B0). (A0和B0)組織染色為OLIG2(黃色)、F-actin(洋紅色)、anti-GFP(綠色)和DAPI(青色)。每個基因型分析n=4-6個胚胎。

                  (CandD)散點圖顯示每個核(C)的延伸和延伸長度(D),從4個Myo10個體的E9.5神經管FPs的SBF-SEM中定量+/+和2 Myo10m1J/m1J每個胚胎有2個掃描序列。大的點/三角形代表個人掃描系列。小的標記表示各個部分。(E–F ") E8.5/14 somite SHH-Cre; Rosa26mT/mG(E) Myo10+/m1J和(F) Myo10m1J/m1J脊索和神經管切片,包括SHH(品紅)、OLIG2(黃色)、F-actin(紅色)、GFP(綠色)和DAPI(藍色)。Myo10+/m1J胚胎表現出脊索來源的延伸(E0和神經管發光的發光斑點(E00,放大箭頭)。

                  (G)E8.5/10-15體細胞Myo10中正常、腹側移位或OLIG2缺失的組織切片的比例+/m1J(n = 8)和Myo10m1J/m1J(n = 3)胚胎顯示。每個胚胎分析3-6個切片,誤差條= SD。

                  (H和I)定量顯示神經管腔內的SHH斑點(H)和穿過管腔根尖表面的SHH信號強度(I)。大的點/三角形代表單個的胚胎。半透明標記表示單個部分。在10-15個體細胞階段,每個基因型有n=6-8個胚胎。

                  (下頁繼續圖例)

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                  在觀察小鼠胚胎組織中的長絲狀偽足的方案,使我們能夠驗證細胞素參與了這種運輸的假設。我們觀察了NC和FP細胞素中的SHH,并提出了信號梯度建立過程中絲狀導管的SHH(圖7R)。與這一假設相一致的是,絲狀肌動蛋白運動MYO10的丟失減少了NC和FP延伸的形成,并破壞了腹側神經管中的SHH信號。值得注意的是,基因和RNA-seq數據表明,MYO10mutantshavereducedsignalingbyadditionalcytoneme貨物蛋白WNT和NOTCH,提示MYO10在促進基于細胞素的形態發生運輸中的一般作用。這種功能為Myo10的神經表型提供了一個潛在的解釋m1J/m1J小鼠從SHH信號梯度的壓縮到嚴重的外腦畸形,這可能是由于WNT通路活性的破壞。36,71,79

                   

                  細胞素有助于頂端SHH的傳遞

                  盡管實驗支持脊椎動物神經管中頂端SHH信號梯度,但刺猬信號是被極化上皮細胞接收的問題仍然是一個激烈爭論的話題。32,35,37,50大多數在缺乏初級纖毛的果蠅翅盤上皮細胞上進行的研究表明,長程Hh信號在基礎上積累。31,32,37在斑馬魚中,SHH積累在發育中的視杯細胞的基底膜上,細胞過表達SHH共受體CDON。80然而,在小鼠中,SHH僅在初始模式信息傳遞后的發育后期被檢測到,并在信號-rcs的基底外側膜上被誘導表達。60我們對神經管SHH分布的研究顯示,在E8.5和E9.5胚胎中,FP細胞沿FP細胞基膜,但該信號不能有效誘導DISP突變體中的FP。這可能是因為,無脊椎動物,頂端初級纖毛是SHH通路控制的關鍵部位。81纖毛膜上的PTCH通過限制SMO激活甾醇的膜積累來調節纖毛SMO。82–85這使得PTCH的纖毛定位池成為SHH必須獲得快速激活smo的必要部分。因此,我們傾向于在形態形成梯度建立過程中,SHH被神經上皮細胞在頂端接收以激活信號的模型。我們推測,在神經管成熟過程中,SHH的纖毛SMO積累有助于增強腹側細胞的命運。這種強化可能是必要的,因為目標細胞對SHH梯度的反應在整個腹側神經管模式中保持動態的。66

                  我們預計,除了促進NC到FP的通信外,細胞素也促進了細胞素之間的通信

                   

                  NC和間充質形成椎間盤髓核。67,68因此,我們觀察到nc衍生的含shh延伸接觸鄰近的間充質細胞并向體延伸。這些結果表明,細胞素從發育組織中心延伸出來,以促進與多個反應細胞群的同時通信,從而在早期發育過程中協調多組織模式。

                   

                  直接交付與擴散

                  如果產生SHH的細胞使用細胞素將形態因子傳遞到反應細胞,擴散起什么作用,細胞外SHH伴侶SCUBE2的具體作用是什么?生化和遺傳學研究表明,SCUBE2保護SHH脂質修飾從細胞外環境,以伴侶輔助擴散。26,27然而,在Scube2中,神經發育并沒有被報道受到損害-/-老鼠30表明與其他SHH運輸機制存在冗余。我們假設細胞素可能提供這種冗余和/或協同的轉運功能,這是由這些不同的轉運機制對DISP細胞內尾部的不同要求所表明的。結果表明,羧基末端尾部對于shh細胞循環和細胞素進入是不能缺少的。相反,已發表的研究表明,尾巴對于disp介導的SHH轉移到SCUBE2是不可缺少的。28因此,在擴散和基于細胞素的轉運過程之間可能會發生合作和/或代償活動,以確保在發育過程中適當的信號分散。

                   

                  研究的局限性

                  為本研究優化的成像方案代表了可視化發育組織中形態運輸的重要技術進展。然而,由于組織深度、大小和神經管組織的技術限制,目前我們無法進行相關光電子顯微鏡或通過組織中的實時成像監測SHH從NC和神經管通過細胞素的運輸。因此,我們還不知道體內細胞素是如何連接的,它們有多穩定,它們是否通過緊密連接獲得頂端纖毛,它們追蹤SHH信號梯度的距離,以及它們的長度是否與梯度步驟相關。未來的研究將集中于增強組織處理和蛋白質標記,以優化具有挑戰性的成像實驗,可用于生成發育胚胎的細胞素通信網絡的高分辨率圖。

                  (J-Q)MYO10缺失會損害背側神經管WNT信號通路。E9.5/25–30 somite Myo10+/m1J和Myo10m1J/m1J神經管切片染色為OLIG3(紅色)(J和K)或pSMAD(紅色)(N和O),用DAPI(藍色)。

                  (LandP)4個對照的平均表達域區域(2 Myo10+/+和2 Myo10+/m1J)和4 Myo10m1J/m1J體細胞階段匹配的胚胎。大的點/三角形代表單個的胚胎。小的標記表示各個部分。所有散點圖數據均以平均±標準差表示。

                  (MandQ)OLIG3(M)和pSMAD (Q)沿背側/腹側(DV)軸的平均熒光強度線圖顯示。虛線表示SEM。n=21-25個基因型4個胚胎的25個切片。請參見圖S6和圖S7。

                  (R)神經管中基于細胞素的信號傳輸模型。細胞素協助部署來自屋頂板的WNT(藍色)和來自脊索和FP的SHH(綠色)?;诩毎氐霓D運可能與SCUBE2輔助的SHH擴散(品紅色/綠色管腔復合物)和WNT的自由擴散(藍點)合作,以完善或增強神經管發育過程中的形態發生信號梯度。

                   

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                  具體方法見本文在線版,包括:

                  .  關鍵資源表

                  .  資源可用性

                  B鉛接觸

                  B材料可用性

                  B數據和代碼的可用性

                  .  實驗模型和研究參與者的細節

                  B小鼠

                  B細胞系和培養條件

                  .  方法詳細信息

                  B Disp小鼠生成

                  B磁共振成像

                  B計算機斷層掃描

                  B步態分析

                  B神經管成像

                  B小鼠胚胎中細胞素的保存和成像

                  B細胞培養中細胞素的保存和分析

                  BSHH斑點的分析

                  脊索和神經管腔

                  B RNA測序

                  B細胞培養的免疫熒光和圖像采集

                  B圖像處理與分析

                  B質粒

                  B蛋白穩定性環己酰亞胺測定法

                  B免疫印跡和免疫共沉淀

                  B球狀體的生成與分析

                  B共定位分析

                  B DISP膜內化

                  B熒光素酶報告分析

                  B掃描電鏡和定量

                  .  B連續塊面掃描電鏡定量與統計分析

                   

                  補充信息

                  補充信息可以在https://doi.org/10.1016/j.cell網站上找到。2023.12.003.

                   

                  確認

                  蒂莫西·桑德斯和哈立德·凱毛里在圖像采集和分析方面進行了咨詢。馬克·哈特利提供了對手稿的評論。rna測序是在SJCRH的哈特韋爾中心進行的。SBF-SEM數據傳輸由SJCRH的生物圖像信息學中心(CBI)進行。圣城。Jude轉基因核心(TCU)生成了Disp1突變體小鼠系。P.海灘和A。薩利克提供的Dispmef和發育研究雜交瘤庫提供了抗體。資助項目:該研究由NIH R35GM122546(to S.K.O.)資助,F31HD110256(至C.A.D.),NCI P30CA021765(SJCRH癌癥中心支持基金)和ALSAC的St。裘德兒童研究醫院。該內容僅由作者負責,并不一定反映資助機構的觀點。

                  作者貢獻

                  概念化,E.T.H.,E.R.C.,M.E.D.,Y.Z.,和S.K.O.;方法論,E.T.H.,E.R.C.,M.E.D.,Y.Z.,R.W.,C.G.R.,C.A.D., S.M.P.-M., Y.-D.W.,D.P.S., E.S.,A.L.和J.S.;軟件,E.T.H.,Y。-D.W.,和A.F.C.;驗證,E.T.H.,E.R.C.,和D.P.S.;形式分析,E.T.H.,Y。Z., S.S.A., Y.-D.W.和J.S.;調查,E.T.H.,E.R.C.,M.E.D.,Y.Z.,R.W.,C.A.D., D.P.S., Y.-D.W.,M.T.,Y.S.R.,J.S.,E.S.,和A.J.;寫作,E.T.H.,e.r.r.c.,M.E.D.,Y.Z.,C.G.R., S.M.P.-M., S.S.A., Y.-D.W.,J.S.,和S.K.O.;可視化,E.T.H.,E.R.C.,S.S.A.,和S.K.O.;監督,C.G.R.,S.M.P.-M.和S.K.O.;以及資金收購,S.K.O.

                  利益聲明

                  作者聲明沒有任何相互競爭的利益。

                  收稿日期:2022年7月26日

                  修訂日期:2023年9月6日

                  接受時間:2023年12月1日

                  出版:2024年1月2日

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                  97.阿伯勒,梅赫塔,梅赫塔,凱爾,喬希,P.S.,弗魯庫斯,C.L.,哈丁,H. A.,施密茨,C.T.和Vezina,C.M. (2011).一種高通量原位雜交方法來表征胎鼠下泌尿生殖道中mRNA的表達模式。J.Vis。. Exp54, 2912.

                  98.考夫曼,M.H。(1992).小鼠發育圖集(愛思唯爾)。

                  99.斯隆,T.F.W.,卡薩米,藝術碩士,容克, D., 葉姆,彼得·立大學,和查倫,F。(2015).shh和Netrin-1的淺層梯度的整合引導連合軸突。PLoS生物體。13, e1002119.

                  100.霍爾,E.T.,和奧格登,S.K。(2018).通過改良的電子顯微鏡固定來保存培養的細胞細胞素。Bio Protoc.8, 8.

                  101.馬拉達,納瓦羅,g., A., 斯圖爾特D.P., Arensdorf,A.M.,納克特蓋爾,S.,安吉拉茨,E.,奧弗曼,J.T.,羅哈吉,R.,麥考密克,P.J.,等人(2015)。n-鏈糖基化在平滑信號轉導中的作用的功能差異。PLoS基因。11, e1005473.

                  102.奧格登,阿斯卡諾,斯特格曼,碩士,蘇伯,L.M.,胡珀,J.E.,和羅賓斯,D.J. (2003).跨膜蛋白平滑與驅動蛋白相關蛋白Costal2之間的功能相互作用。柯爾。比奧爾。13, 1998–2003.

                  103.佐佐木,H.,慧,C.C.,中福子,M.,孔藤,H。(1997).Gli蛋白的結合位點對于轉基因中HNF-3底板增強子活性至關重要,并可在體外對Shh作出反應。發展124、1313-1322。

                  104.陳,J.K.,泰帕爾,J.,庫珀,M.K.,和比奇,P. A.。(2002).通過直接結合環巴胺來平滑來抑制刺猬信號通路。基因開發。16, 2743–2748.


                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                  18號細胞187,1-18,2024年1月18日


                  關鍵資源表

                   

                   

                  試劑或資源

                  標識符

                  抗體

                  雞多克隆抗GFP

                  鳥類

                  Cat# GFP-1020; RRID: AB_10000240

                  小鼠單克隆抗pax6

                  DSHB

                  Cat# pax6; RRID: AB_528427

                  兔多克隆抗Olig2

                  米利波爾

                  Cat# AB9610; RRID: AB_570666

                  兔多克隆抗foxa2

                  阿布卡姆

                  Cat# ab108422; RRID: AB_11157157

                  兔多克隆抗nkx2.2

                  諾夫斯

                  Cat# NBP1-82554; RRID: AB_11005513

                  小鼠單克隆抗shh(上清液)

                  DSHB

                  Cat# 5E1; RRID: AB_528466

                  兔多克隆抗arl13b

                  蛋白質技術

                  Cat# 17711-1-AP; RRID: AB_2060867

                  兔多克隆抗shH(H160)

                  圣克魯斯生物技術

                  Cat# sc-9024; RRID: AB_2239216

                  大鼠單克隆抗HA(克隆3F10)

                  巖石

                  Cat# 11867423001; RRID: AB_390918

                  兔單克隆抗磷酸化-Smad1(Ser463/465)/Smad5(Ser463/465)/Smad9(Ser465/467)(D5B10)

                  細胞信號技術

                  Cat# 13820; RRID: AB_2493181

                  兔單克隆抗OLIG3(JE56-40)

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# MA5-44904; RRID: AB_2931360

                  小鼠單克隆抗V5標記(SV5-Pk1)

                  (正式編號46-0705)

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# R960-25; RRID: AB_2556564

                  小鼠單克隆抗rab5(E6N8S)

                  細胞信號技術

                  Cat# 46449; RRID: AB_2799303

                  兔單克隆抗rab7(D95F2)

                  細胞信號技術

                  Cat# 9367; RRID: AB_1904103

                  兔單克隆抗rab11(D4F5)

                  細胞信號技術

                  Cat# 5589; RRID: AB_10693925

                  兔多克隆抗Rab4

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# PA3-912; RRID: AB_2269382

                  兔單克隆抗Caveolin-1(D46G3)

                  細胞信號技術

                  Cat# 3267; RRID: AB_2275453

                  兔單克隆抗網格蛋白重鏈(D3C6)

                  細胞信號技術

                  Cat# 4796; RRID: AB_10828486

                  小鼠單克隆抗阿爾法自適應素

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# MA3-061; RRID: AB_2056321

                  兔單克隆抗shh(C9C5)

                  細胞信號技術

                  Cat# 2207; RRID: AB_2188191

                  兔單克隆抗kif5b

                  阿布卡姆

                  Cat# ab167429; RRID: AB_2715530

                  小鼠單克隆抗微管蛋白(DM1A)

                  細胞信號技術

                  Cat# 3873; RRID: AB_1904178

                  兔多克隆抗2適應蛋白

                  貝謝爾

                  Cat# A304-718A; RRID: AB_2620913

                  山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 488

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-11029;RRID: AB_2534088

                  山羊抗兔IgG(H+L)高交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 488

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-11034;RRID: AB_2576217

                  山羊抗大鼠IgG(H+L)交叉吸附

                  二抗,Alexa Fluorm 488

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-11006;RRID: AB_2534074

                  山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 555

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-21424;RRID: AB_141780

                  山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 555

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-21429;RRID: AB_2535850

                  山羊抗大鼠IgG(H+L)交叉吸附二抗,Alexa熒光555

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-21434;RRID: AB_2535855

                  山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 647

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-21236;RRID: AB_2535805

                  山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 647

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-21245;RRID: AB_2535813

                  AlexaFluor488-親和純F(ab‘)2片段

                  驢抗雞IgY(IgG)(H+L)

                  杰克遜免疫研究實驗室

                  Cat# 703-546-155; RRID: AB_2340376

                  AlexaFluor488-親和純F(ab‘)2片段

                  驢抗大鼠IgG(H+L)

                  杰克遜免疫研究實驗室

                  Cat# 712-546-150; RRID: AB_2340685

                  (在下一頁繼續)

                   

                  細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e1


                   

                  繼續

                  試劑或資源

                  標識符

                  抗小鼠IgG(H+L),F(ab’)2片段

                  (Alexa Fluor命647共軛)

                  細胞信號技術

                  Cat# 4410; RRID: AB_1904023

                  抗小鼠IgG(H+L),F(ab’)2片段

                  (Alexa Fluor 555共軛)

                  細胞信號技術

                   

                  抗小鼠IgG(H+L),F(ab)2片段

                  (Alexa Fluor 488共軛)

                  細胞信號技術

                  Cat# 4408; RRID: AB_10694704

                  抗兔IgG(H+L),F(ab)2片段

                  (Alexa Fluor 555共軛)

                  細胞信號技術

                  Cat# 4413; RRID: AB_10694110

                  山羊抗兔IgG(H+L)交叉吸附

                  二抗,Alexa Fluor似750

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# A-21039;RRID: AB_2535710

                  過氧化物酶親和純驢子抗小鼠IgG(H+L)

                  杰克遜免疫研究實驗室

                  Cat# 715-035-151; RRID: AB_2340771

                  過氧化物酶親和純驢抗兔IgG(H+L)

                  杰克遜免疫研究實驗室

                  Cat# 711-035-152; RRID: AB_10015282

                   

                  杰克遜免疫研究實驗室

                  Cat# 112-035-175; RRID: AB_2338140

                  化學物質、多肽和重組蛋白

                  組織-Plus似O.C.T.復合物

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# 23730571

                  UltraPure似低熔點瓊脂糖

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# 16520050

                  ProLong似鉆石抗褪色支架

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# P36961

                  ProLong似玻璃防褪色支架

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# P36980

                  ProLong似黃金抗褪色安裝與DAPI

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# P36941

                  氟蒙特-G似安裝介質

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# 00-4958-02

                  正常山羊血清

                  杰克遜免疫研究實驗室

                  Cat# 005-000-121; RRID: AB_2336990

                  HBSS,鈣,鎂,無苯酚紅

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# 14025076

                  杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水,10倍含鈣和鎂

                  成粒

                  Cat# 20-030-CV

                  DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# D3571

                  ActinRed似555 ReadyProbes似試劑

                  (羅丹明酚醛樹脂)

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# R37112

                  EZview似紅色抗ha親和凝膠

                  微孔Sigma

                  Cat# E6779

                  Pitstop 2

                  阿布卡姆

                  Cat# ab120687

                  Lipofectamine似3000轉染試劑

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# L3000001

                  次氯酸多西環素

                  微孔Sigma

                  Cat# D5207

                  EZ-LinkSulfo-NHS生物素

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# 21217

                  RNAscope似 ProbeMm-Gli1

                  ACD

                  Cat# 311001

                  環己酰亞胺

                  微孔Sigma

                  Cat# 01810

                  蛋白A/GPLUS-瓊脂糖

                  圣克魯什

                  Cat# sc-2003

                  關鍵商業分析

                  DIG RNA標記試劑盒(SP6/T7)

                  巖石

                  Cat# 11175025910

                  ECL似是一個主要的西部印跡系統

                  微孔Sigma

                  Cat# GERPN2232

                  RNAscope似多重熒光試劑

                  套件v2

                  ACD

                  Cat# 323100

                  RNeasy微型套件

                  氣根

                  Cat# 74004

                  TruSeq RNA文庫準備試劑盒v2

                  伊盧米納

                  Cat# RS-122-2001

                  雙熒光素酶報告基因檢測系統

                  Pro超級

                  E1960

                  存放數據

                  批量Disp RNA序列

                  這篇論文

                  GEO: GSE242161

                  Bulk Myo10 RNA序列

                  這篇論文

                  GEO: GSE242161

                  實驗模型:細胞系

                  肌肉Mus:NIH3T3

                  美國模式培養物保藏所

                   

                  小家鼠:神經-2a ATCC RRID: CVCL_0470

                  (在下一頁繼續)

                  e2細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日


                   

                   


                   

                   

                  繼續

                  試劑或資源

                  標識符

                  肌鼠:派遣KO(DispKO)MEF

                  媽媽等等。22和圖卡欽斯基塔爾。26

                  N/A

                  小家鼠: DispKO SHH MEF

                  斯圖爾特等人。39

                  N/A

                  小家鼠:MEF野生型

                  指控。36

                  N/A

                  小家鼠:Myo10KOmef

                  指控。36

                  N/A

                  Mus肌肉: IMCD-3

                  美國模式培養物保藏所

                  RRID: CVCL_0429

                  MusMus:光II

                  美國模式培養物保藏所

                  RRID: CVCL_2721

                   

                  美國模式培養物保藏所

                  RRID: CVCL_0422

                  實驗模型:生物體/菌株

                  C57BL/6J(野生型)

                  美國

                  RRID: IMSR_JAX:000664

                  B6.129(Cg)-Gt (ROSA)26

                  索特姆4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (mT/mG)

                  美國

                  RRID: IMSR_JAX:007676

                  B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J

                  美國

                  RRID: IMSR_JAX:005622

                  B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J

                  美國

                  RRID: IMSR_JAX:008466

                  B6.Cg-Myo10m1J/GrsrJ

                  美國

                  RRID: IMSR_JAX:024583

                  C57BL/6-Disp1印第安納州/+

                  這篇論文

                  N/A

                  C57BL/6-Disp1CS/+

                  這篇論文

                  N/A

                  寡核苷酸

                  CRISPR-Cas9編輯結構(見表S1)

                  這篇論文

                  N/A

                  DISP1編輯結構(見表S1)

                  這篇論文

                  N/A

                  重組DNA

                  pcDNA3.1(+)(對照載體)

                  塞莫費舍爾科學

                  Cat# V79020

                  pCDNA3-EGFP

                  由道格·戈倫博克贈送的禮物

                  RRID: Addgene_13031

                  pCMV-mCherry膜

                  約斯特等人。86

                  RRID: Addgene_55779

                  pCMV-R-GECO1

                  趙等人。87

                  RRID: Addgene_32444

                  pCMV-mCherry2

                  這是邁克爾·戴維森送來的禮物

                  RRID: Addgene_54517

                  pCDNA3.1-mSHH-FL

                  斯圖爾特等人。39

                  N/A

                  pCDNA3.1-mSHH-FL-EGFP

                  指控。36

                  N/A

                  pCDNA3.1-V5-DISPWT-HA

                  斯圖爾特等人。39

                  RRID: Addgene_126410

                  pCDNA3.1-V5-DISPCS-HA

                  斯圖爾特等人。39

                  N/A

                  pCDNA3.1-V5-DISPΔC-HA

                  這篇論文

                  N/A

                  pCDNA3.1-V5-DISP4xAA-HA

                  這篇論文

                  N/A

                  pCDNA3.1-V5-DISPWT-Dronpa3-HA

                  這篇論文

                  N/A

                  pCDNA3.1-V5-DISPCS-Dronpa3-HA

                  這篇論文

                  N/A

                  pCDNA3.1-DISP ΔC-Dronpa3-HA

                  這篇論文

                  N/A

                  Dronpa3-N1

                  這是邁克爾·戴維森送來的禮物

                  RRID: Addgene__54682

                  pLVX-Tet-On 3G

                  塔卡拉

                  Cat# 631187

                  pCMV3-hBMP2-GFPSpark

                  中國生物

                  Cat# HG10426-ACG

                  pCMV3-hBMP4-OFPSpark

                  中國生物

                  Cat# HG10609-ACR

                  pCMV3-hBMP7-GFPSpark

                  中國生物

                  Cat# HG10083-ACG

                  pCMV3-hWNT1-GFPSpark

                  中國生物

                  Cat# HG10721-ACG

                  軟件和算法

                  斐濟(ImageJ)(v2.9.0)

                  辛德里尼塔爾。88RRID: SCR_002285

                  http://fiji.sc

                  CellProfiler (v4.2.5)

                  麥奎內塔爾。89RRID: SCR_007358

                  http://cellprofiler.org

                  Ilastik (v1.4.0)

                  貝爾蓋塔爾。90RRID: SCR_015246

                  http://ilastik.org/

                  CATMAID (v2021.12.20)

                  薩爾菲爾德等人。72

                  施耐德-米澤爾等等。91

                  RRID: SCR_006278

                  http://catmaid.org/

                  短劍py (v2.0)

                  Connellyet al.92

                  https://github.com/patrickc01/CRIS.py

                  (在下一頁繼續)

                   

                   

                  細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e3


                   

                   

                  繼續

                  試劑或資源

                  標識符

                  徠卡應用程序套件X(LAS X)(v4.0.0)

                  徠卡RRID: SCR_013673

                  https://www.leica-microsystems。。com/ products/microscope-software/

                  details/product/leica-las-x-ls/

                  NIS元素(v5.41.02)

                  尼康RRID: SCR_014329

                  https://www.nikoninstruments。。com/ Products/Software

                  圖頁棱鏡(v8.0)

                  GraphPad RRID: SCR_002798

                  http://www.graphpad。。com/

                  Amira(2020.3版)

                  熱費雪RRID: SCR_007353

                  http://www.fei。。com/software/

                  amira-3d生命科學/

                  Inveon研究工作場所(v3.0)

                  西門子

                  投資公司-研究公司-工作場所。software.informer.com/

                  分子簽名數據庫(GSEA)(v2023.1。

                  蘇布拉曼尼安等人。93RRID: SCR_016863

                  http://software.broadinstitute.org/

                  gsea/msigdb/index.jsp

                  Photoshop(v24.3)

                  Adobe RRID: SCR_014199

                  https://www.adobe。。com/products/ photoshop.html

                  插畫家(v27.4.1)

                  Adobe RRID: SCR_010279

                  http://www.adobe。。com/products/

                  illustrator.html

                  首映式Pro(v15.4.1)

                  Adobe RRID: SCR_021315

                  https://www.adobe。。com/products/ premiere.html

                  CLC基因組學服務器(v23.0.4)

                  Qiagen RRID: SCR_017396

                  https://www.qiagenbioinformatics.產品,基因組學,服務器

                  Partek基因組學套件(v7.0)。RRID: SCR_011860 http://www.帕爾特克。com/?q=partekgs

                   

                  資源可用性

                  引線接觸

                  進一步的資源和試劑的信息和要求應直接聯系主要聯系人Stacey Ogden(stacey.ogden@ stjude.org)。

                  材料可用性

                  根據完成機構材料轉讓協議,可提供本研究中產生的試劑。蛋白表達載體將存放在Addgene上。

                  數據和代碼可用性

                  .大量RNA測序數據已存儲在基因表達綜合數據庫中,并可在https://www上公開獲得。關鍵資源表中列出的登錄號GSE242161下的ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi。報告的所有數據

                  在本文中,領導聯系人將根據要求進行共享。

                  .  本文沒有報告原始代碼。

                  .  重新分析本工作文件中報告的數據所需的任何額外信息均可根據要求從領導聯系人處獲得。

                   

                  實驗模型和研究參與者的細節

                  小鼠

                  本研究中的小鼠實驗是在圣猶大兒童研究醫院的機構動物護理和使用委員會(IACUC)批準的方案下進行的(方案608-100616)。圣猶大機構動物護理和使用委員會根據《動物護理和使用指南》批準了所有程序。小鼠按照IACUC標準飼養在微隔離籠中,以減少病原體暴露。鼠標住房設施運行在一個12-12個自動照明系統上(12小時照明打開,12小時照明關閉),并帶有一個獨立的通風系統。小鼠被喂食標準食物和隨意飲水。在這些研究中進行的分析顯示,除了將動物體重分別按性別進行分析和與感興趣的基因型進行比較外,性別之間沒有差異。在我們的分析中,男性和女性的標本都是相同的。關于發育階段和基因型的完整信息可以在圖例、方法細節和關鍵資源表中找到。雌性小鼠的年齡在不同

                   

                   

                  e4細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日


                   

                   


                   

                   

                  6-12周用于定時妊娠進行胚胎研究。從出生時開始,每周給新生兒稱重。步態分析從2周齡開始進行到6個月齡,并有年齡和性別匹配的隊列。

                  細胞系和培養條件

                  細胞在37歲時培養。C在5%一氧化碳2在培養基中(DMEM或DMEM F12含有4.5g/LD-葡萄糖,[-]酚紅,[-]L-谷氨酰胺,[-] HEPES,[-]丙酮酸鈉,2mML-谷氨酰胺,1mM丙酮酸鈉,1X非必需氨基酸,1%青霉素鏈霉素溶液(Gibco))。MDCK(NBL-2)、IMCD3(CRL-2123)、Shh Light II(CVCL_2721)和NIH3T3(CRL-1658)從ATCC公司中獲得。顯示器1-/-敲除(顯示器) MEFs,22,26和迪斯普穩定表達SHH的mef在之前已經描述過。39Myo10重量和Myo10-/-來自男性胚胎的mef來源于以前的研究。36使用Flp-In系統(Thermo科學公司)開發了穩定表達感興趣蛋白的克隆細胞系。pCDNA 5 FRT Disp重量或DispCS(V5/HA標記)和pOG44flp-重組酶載體被轉染,并使用潮霉素進行篩選。穩定表達DISP的IMCD3細胞系重量或DISPCS(V5/HA標記)使用Flp-In系統生成,創建LacZ-FRT單克隆,然后創建pCDNA5FRTDISP重量或DISPCS(V5/HA標記)轉染并使用潮霉素進行篩選。使用pLVX-Tet-On 3G系統(Takara Bio),用dox誘導的SHH病毒感染Flp-In mIMCD3s,其病毒MOI為2。在抗殺蟲素選擇后,細胞保持在G418中以保持穩定的整合。所有細胞系均通過功能分析和免疫印跡法進行常規驗證,并每月用真菌警報(龍沙)檢測支原體污染。根據制造商的說明,用脂質體3000和P3000試劑(賽默飛世爾科學公司)轉染質粒DNA進行瞬時蛋白表達。當需要時,通過添加對照載體DNA,使用于轉染的DNA的最終摩爾量保持不變。

                  方法詳細信息

                  Disp小鼠生成

                  演示1英德爾(-11bp)和Disp1CS使用CRISPR-Cas9技術和直接受精卵注射建立突變小鼠模型。sgRNAs被設計為與小鼠基因組中的任何其他位點至少有3個堿基對(bp)的錯配,并在所需的修飾位點的50 bp范圍內結合。在胚胎注射前,檢測兩種化學修飾的sgRNAs(Synthego)在穩定表達Cas9的小鼠neuro2a細胞(ATCC)中的活性,并通過靶向下一代測序(NGS)進行檢測,如前所述(DOI: 10.1038/s41598-018-19441-8)。94所得到的NGS數據使用CRIS進行分析。py (DOI: 10.1038/s41598-019-40896-w).92裂解活性最高的sgRNA(SNP5。DISP1.g15)用于受精卵注射。將一個ssODN供體(10ng/ul,IDT)與Cas9 mRNA(10ng/ul,TriLink)和SNP5共注射。DISP1.g15(5ng/ul),用于創建Disp1CS小鼠模型ssODN設計為60 bp的同源臂278AAA突變,以及一個沉默的阻斷修改,以防止在一個成功的整合事件后的重新切割。演示1英德爾小鼠模型是由SNP5裂解后的非同源端連接事件產生的雙產物。DISP1.g15.注射受精卵并轉移到0.5 dpc的假孕胎兒(7-10周齡的雌性與輸精管切除的雄性交配)。95編輯結構及相關引物見表S1。在正確修改的創始人動物被確認后,小鼠被回交四代。

                  磁共振成像

                  磁共振成像(MRI)是在Bruker Clinscan 7T MRI系統(Bruker Biospin MRI有限公司,埃特林根,德國)上進行的。掃描前,小鼠在一個腔室中麻醉(3%異氟烷氧氣1 L/min),并使用鼻錐輸送(1-2%異氟烷氧氣1 L/min)維持。為動物提供熱支持,使用一個帶有溫水循環的加熱床和一個生理監測系統來監測呼吸率。MRI采集在小鼠頭部上方放置小鼠腦容量線圈,并放置在72 mm的發射/接收線圈內。定位器完成后,在水平(TR/TE = 3080/40 ms,矩陣大小= 256 x 256,視野= 36 mmx 36 mm,切片厚度= 0.5毫米,切片數= 20),冠狀(TR/TE=/60/42 ms,矩陣大小= 192 x 192,視野= 15毫米x15毫米,切片厚度= 0.5毫米,切片數量= 30),矢狀面(TR/TE=350/80/39 ms,矩陣尺寸= 128 x 256,視野= 16 mm x 32 mm,切片厚度= 0.5毫米,切片數= 24)定向分析3D切片機進行MRI圖像(外科規劃實驗室)。打開冠狀面圖像,并添加了一個新的分割方法。. 通過只繪制包含大腦的圖像區域,為整個大腦創建了感興趣的區域。這種情況一直持續到所有的切片上,直到整個大腦都被畫了出來。大腦的體積是通過測量根據體素尺寸計算出的繪制區域的體積來確定的。同樣,對小腦進行了第二次分割,并以同樣的方式計算其體積。

                  計算機斷層掃描

                  計算機斷層掃描(CT)是在西門子Inveon PET/CT系統(西門子公司)上進行的,分辨頻率為45 mm各向同性分辨率。小鼠被麻醉和支持如上所述??倰呙钑r間為16分34秒。使用Inveon研究工作場所軟件(西門子)完成對CT圖像的分析。L1-L10的測量值是根據預定義的測量位置來確定的(見圖S1)。

                   

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                  步態分析

                  一條60厘米長、5厘米寬的跑道上襯有特曼紙。小鼠(2周至6個月)在進行實驗前被訓練穿過跑道。老鼠的爪子被涂上了兩種不同的顏色,分別作為前肢(藍色)和后肢(紅色)。. 對于每只小鼠,至少記錄3次跑步(每只動物30-45步),并分析每只肢體的步態比(b/a)由左爪到左(a)和相應的右爪(b)之間的足跡距離(DOI:10.11111/j.1601-183X.2004.00072.x)確定。96可視化情況見圖1I。

                  神經管成像

                  野生型C57BL/6J(JAX#000664)、Rosa 26 mT/mG(JAX # 007676)、Shh-Cre(JAX#005622)、Shh::gfp(JAX#008466)、Myo10m1J(JAX#024583)和C57BL/6背景下的Disp1突變體胚胎,并進行免疫組化處理。采用E8.5 (8-15體)或E9.5 (25-30體)期胚胎進行分析,并比較相同體數量的胚胎。取妊娠母鼠,取子宮角,用1X PBS解剖胚胎,然后沖洗3次。整個胚胎在立體顯微鏡(徠卡)上進行成像。胚胎在室溫下用4% PFA固定1小時,用1X PBS沖洗3次,然后移至30%蔗糖中進行冷凍保護。第二天,胚胎被冷凍在O.C.T.中干冰上的化合物(組織-Tek)。胚胎在徠卡微米CM1950低溫恒溫器上以10 mm厚的橫向切片。切片短暫干燥,用1X TBST洗滌,然后用2% BSA、1%山羊血清、0.1% Triton-X-100在1X PBS中封閉??贵w在封閉緩沖液中稀釋,在加濕室中室溫孵育過夜。使用以下抗體和稀釋劑:雞抗GFP(1:500,牛,GFP-1020)、小鼠抗PAX6(1:25,DSHB,PAX6)、兔抗OLIG2(1:300,微孔,AB9610)、兔抗FOXA2(1:250,ab108422)、兔抗OLIG3(1:500,熱費舍爾,JE56-40)、兔抗pSMAD1/5/9(1:1000,CST,13820)和兔抗NKX2.2(1:200,Novus Bio、NBP1-82554)。去除一抗,切片用1XTBST洗滌3次,然后用1:500稀釋的二抗(Invitrogen)孵育3小時。切片用1XTBST洗滌3次,然后用自來水沖洗,干燥,然后用延長金剛石安裝介質涂抹覆蓋物。切片在徠卡DMi8廣角顯微鏡上成像,并使用LAS X進行處理。每個基因型至少分析5個胚胎。

                  對于RNAscope,采集E9.5胚胎,固定,包埋,并按上述方法進行切片。安裝后,切片按照制造商的協議(文件323100-USM)用MmGli1-C1探針,使用RNAscopem多重熒光試劑Kitv2(ACD)對mm1-C1探針(ACDBio #311001)進行染色??乖崛?0分鐘,蛋白酶-iii處理30分鐘。對于信號的發展,Opal-570在1:1000時使用。

                  對于原位雜交,收集E9.5胚胎并在4時固定4小時。C在4% PFA。原位雜交實驗如前所述(DOI: 10.3791/2912)進行97并進行以下修改。冷凍胚胎在15毫米厚下橫向切片,并安裝在帶電的玻片上。感覺和抗感地高辛標記的RNA探針按照制造商的說明使用DIG RNA標記試劑盒(Roche)制作。用感覺探針作為陰性對照,未觀察到陽性信號。每個基因型分析3個胚胎。

                  使用斐濟(ImiageJ)(DOI:10.1038/nmeth019)對神經管切片進行定量分析。.288所有的分析均在心臟水平的橫切面上進行,通過鰓囊、主動脈囊的位置和心房/心室的大小/形態來確定。小鼠發育板19b的考夫曼圖譜圖像g-h顯示了我們所示的心臟水平圖像圖2的區域,并進行了表達域定量分析。98通過測量神經元祖細胞標記物(PAX6、OLIG2、NKX2.2、FOXA2)相對于整個神經管區域的表達域面積,分析位于體2附近的橫向心臟水平切片。每個基因型分析3~5個胚胎,每個胚胎分析5~8個切片。通過測量所示表達域的面積,并將其歸一化為每個切片中所分析的神經管的總面積,來計算表達域面積。

                  表達域強度線繪圖數據如之前報道的那樣生成(DOI: 10.1371/journal。pbio.1002119).99簡單地說,通過神經管兩側的神經上皮細胞的中心團塊,追蹤出一條20像素寬的線。從底板中線的底面到頂板中線的基面。每個基因型有3個胚胎,每個胚胎共分析4-8個切片。除Gli1原位雜交圖未轉化且基于檢測到的熒光外,單個線圖歸一化,最小值設置為0,最大值設置為100。數據用所有線± SEM的平均強度表示。與線形圖數據一樣,測量祖細胞標記物的相對和絕對背側/腹側位置,其值基于從底板中線通過神經上皮細胞中心質量到頂板中線的距離。相對位置值被確定為每個分析切片的總FP與RP軌跡長度的比值。記錄每個標記物的表達域、背側起始位置和腹側端點,并進行不同基因型間的比較。從FP中線到RP的直線測量垂直D/V長度。每個基因型有3個胚胎,每個胚胎有5~8個切片。

                  小鼠胚胎中細胞素的保存和成像

                  準備對胚胎進行細胞素分析(DOI: 10.3791/64100)。57胚胎被解剖成不完全生長的培養基,然后用漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)沖洗。胚胎在HBSS+4%多聚甲醛中輕輕搖晃固定45分鐘。固定后,用含Ca的PBS洗滌胚胎3次2+和鎂2+和0.1%的Triton,每次洗30分鐘。胚胎在塊狀(含Ca2+和鎂2+,0.1%的Triton,和5%的山羊

                   

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                  血清)與溫和的攪拌。然后胚胎在一抗溶液中孵育(抗體用PBS稀釋2+和鎂2+,0.1% Tween-20和5%山羊血清)472小時。C與溫和的搖擺。使用以下抗體:雞抗GFP(1:250,Aves、GFP-1020)、小鼠抗SHH(1:100、DSHB、5E1上清)、兔抗Olig2(1:300、微孔、AB9610)和兔抗ARL13B(1:500,蛋白蛋白,17711-1-AP)。初次孵育后,胚胎在溫和攪拌下連續洗滌5次,持續1小時。胚胎在F(ab’)中孵育2片段二抗溶液(1:1000抗體稀釋)72小時,輕輕旋轉4小時。C在黑暗中。如果不需要肌動蛋白染色,胚胎與DAPI孵育1小時,然后用方塊洗滌3次,每次10分鐘。最后一系列用PBS洗滌三次20分鐘2+和鎂2+,取0.1% Tween-20,包埋前將胚胎保存在溶液中。

                  胚胎用4%的低熔點瓊脂糖溶解在HBSS或PBS中2+和鎂2+.包埋的胚胎用100或150毫米的振動計進行切片。f-肌動蛋白染色,切片用放線菌(熱fisher)和DAPI孵育40分鐘,然后切片用塊洗滌一次,然后用Ca在PBS中洗滌兩次. 2+和鎂2+,0.1% Tween-20,每次洗20分鐘。切片用延長金剛石法安裝在載玻片上。組織切片用TCS SP8 STED 3X共聚焦顯微鏡(徠卡)成像,然后在光子計數模式下進行閃電反褶積計數或衛星tauSTED(徠卡)成像。每個基因型至少有3個胚胎被分析,所有基因型之間的比較進行相同數量的體匹配胚胎。為了減輕來自低水平非特異性GFP信號的干擾,所有SHH的體內定量均使用抗SHH信號進行計算。

                  細胞培養中細胞素的保存與分析

                  細胞固定和染色采用mem固定方案(DOI: 10.21769/BioProtoc。2898).100轉染后再復制到蓋玻片上,細胞用4%甲醛、0.5%戊二醛和0固定。1M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶液,持續7分鐘。從這一點開始,所有的溶液都被輕輕地移液,以減少在清洗期間對盤子的攪拌。固定后,用PBS洗滌細胞3次,每次洗滌5分鐘。細胞在由5%正常山羊血清和0.1% Triton X-100組成的緩沖液中滲透,1 mg/mlNaBH4溶液在蒸餾水中溶解45分鐘。有關抗體孵育的詳細信息,請參閱“免疫熒光和成像染色方案”部分。

                  我們將用于定量的細胞素定義為直徑約為<200 nm、最小長度為10 mm的細胞投射物(DOI: 10.7554/eLife。61432).36任何沿著其整個長度與覆蓋物保持持續接觸的細胞突起都被排除在分析之外。100細胞素發生率計數在3個覆蓋物中至少100個細胞,至少2個生物重復。細胞素與細胞體的平均熒光強度比是通過測量單個細胞素的平均熒光強度超過其原始細胞體的平均熒光強度來計算的,每個條件下共分析n=44-80個細胞素。通過測定2個生物重復中n=44或46個細胞素內每個蛋白的相對熒光強度比,分析DISP變異與SHH-GFP的線性回歸分析。

                  使用Ca測量基于細胞素的SHH信號激活2+SHH接收細胞的通量速率如下所述。36. 簡單地說,將2 mg質粒DNA轉染到6孔板pCMV-R-GECO1的單個孔細胞中,用于NIH3T3“接收”傳感器細胞,將pCDNA3-mSHH-FL-EGFP用于DISP變體MEF“產生”細胞。轉染24小時后,細胞被胰蛋白酶化,并復制到8個孔,聚苯乙烯室,放置在1.5硼硅酸鹽蓋玻璃上,0.7厘米2/嗯(Nunc實驗室-TekII)。將細胞接種到以…40%的細胞密度(20% R-GECO,20% SHH-GFP)培養出來的腔室孔中,并在成像前恢復至少4小時。在PBS中輕輕清洗細胞,在成像前用新鮮培養基替換培養基以去除分泌的SHH,以確保信號來自細胞素傳遞的配體。在37歲時進行了實時成像。C, 5% CO2. 在整個細胞素深度(…4-6mm)上,每個區域進行15 min的共振掃描,z步長為…0.6-1.0mm生成最大強度投影,用于后續的時間間隔分析。對每個細胞的R-GECO熒光強度直方圖進行歸一化處理,最小熒光為0,最大熒光為100。加拿大2+通量的發生被量化為R-GECO熒光的相對峰值,最小熒光峰值為50。只有與來自SHH-GFP產生細胞的細胞素接觸的R-GECO細胞被定量進行分析,任何在掃描期間沒有顯示出單一通量的R-GECO細胞都被排除在分析之外。從3個生物重復中,每個條件下共分析了n個=31-41個細胞。

                  脊索和神經管腔內沿細胞素的SHH斑點分析

                  我們開發了一個工作流程管道來量化從脊索到周圍細胞和組織的數量。未處理的抗SHH通道從。使用斐濟(圖像J)從掃描系列中提取以0.33mmz步間隔拍攝的50-90張圖像. 88并進行快速傅里葉變換(FFT)帶通濾波。其余的通道染色(DAPI,F-actin,anti-GFP)被合并并總結作為一個細胞輪廓掩膜。然后通過Ilastik(DOI: 10.1038/s41592-019-0582-9)運行單元格輪廓掩碼系列90訓練生成一個定義細胞體和細胞素的分割掩模系列。然后將分割掩模和過濾后的SHH系列在斐濟進行重組88與圖像計算器的功能。通過閾值法(閾值法采用最大熵分析,范圍為10-100)確定SHH斑點,然后將粒子分析設置為10-60像素,以排除過小或過大的斑點。每個基因型分析了9到15個組織切片,代表440-797張圖像。

                  通過閾值化和計數前10 mm內的管腔SHH斑點,對E8.5胚胎的管腔SHH斑點進行定量

                  (…30個z步)的組織切片與斐濟。88在連續的z步中,相同位置的斑點只計算一次。共計

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                  . 分析每個基因型6-8個胚胎的18-20個切片,以量化SHH神經管腔(NTL)信號強度,沿NTL繪制一個感興趣區域(ROI),并在NT細胞體內繪制第二個ROI作為背景校正。每個切片的平均信號強度由平均NTL信號減去平均NT信號來確定。所有的體內定量均采用抗SHH信號進行。

                  測序

                  顯示器1CS/+雌性與Disp1雜交印第安納州/+雄性產生E9.5對照(野生型)和Disp1CS/INDEL晶胚同樣,Myo10m1J/+雌性與Myo10雜交m1J/+雄性產生E8.5對照(Myo10+/+)和Myo10m1J/m1J晶胚收集多個窩,每個基因型使用5對體匹配的窩崽(5個對照,5個突變體),以最大限度地提高遺傳變異。采集妊娠母鼠,解剖胚胎,每個胚胎置于1.5 mL的埃彭多夫管中,在液氮中快速冷凍,然后在-80℃保存,進行基因分型。一旦產生5對胚胎,所有樣本同時純化。每個整個胚胎均質,使用RNeasy Micro Kit(Qiagen)使用制造商的協議提取RNA。每個樣本根據manufacturer‘sinstructions,使用RruSeqRNA樣本Prep v2試劑盒(Illumina)制備1 mg的RNA測序文庫,并在Illumina NovaSeq 6000上完成測序。使用CLC基因組學工作臺v20.0.4(10agen)篩選質量(類似Q20或更長),并與小鼠參考序列GRCm39(UCSC mm39)對齊。TPM(每百萬轉錄本)計數由CLC RNA-Seq分析工具生成。差異基因表達分析采用非參數方差分析,使用Kruskal-Wallis和Dunn對兩個實驗組的對數轉換的檢驗,在Partek基因組套件v7.0軟件(Partek Inc.)中實現。使用GSEA (DOI: 10.1073/pnas。0506580102).93數據集已存儲在基因表達綜合系統上,并可在登錄號(GSE242161)下公開獲得。

                  細胞培養用的免疫熒光和圖像采集

                  細胞在覆蓋物上生長,然后用PBS沖洗3次,4%多聚甲醛固定,然后用0.1%Triton+PBS沖洗3次5分鐘,用塊孵育(PBS,0。兔抗SHH(1:100、160)、1:800、46449)、兔抗V5(1:300、1:200、CST、Pk1)、兔抗Rab11(1:1:800、1:200、1:200、CA2)、CST、51:1)、1:100)、兔抗網格蛋白重鏈(1:1:100、CST、4796)。. . 第二天,用塊洗滌3次,10分鐘,使用二抗(杰克遜免疫研究和邀請試劑),1:1000稀釋,加入DAPI和肌動蛋白紅(邀請試劑)孵育1小時。使用延長玻璃抗褪色支架(Invitrogen)清洗和安裝蓋板。顯微鏡圖像用TCS SP8 STED 3X共聚焦顯微鏡(Leica)或A1R共聚焦(尼康)拍攝,用于固定和活細胞成像。

                  圖像處理與分析

                  圖像采集后,使用LAS X(Leica)、ImageJ、88和Photoshop 2022(Adobe),并使用插畫家2022(Adobe)制作數字。在TCS SP8 STED 3X共聚焦顯微鏡上獲得的神經管細胞質鏡成像,使用閃電軟件(徠卡)進行反褶積。用ImageJ處理視頻,88LAS X,Amira(ThermoFisher)和首映式Pro(Adobe)。EM圖像數據使用Amira(熱莫費舍爾)、Ilastik、90以及用于大量圖像數據的協作注釋工具包(貓女)(DOI:10.1093/bioinformatics/btp266)。72,91除非另有說明,圖像以跨越單元或感興趣區域的z-堆棧采集的最大強度投影(MIP)表示。除非另有說明,所顯示的圖像代表了在多個實驗中至少三個生物復制的標準細胞或組織切片。

                  質粒

                  在本研究中使用了以下質粒:

                  pCDNA(控制載體)(克隆技術V79020),pCMV3-hBMP2-GFPSpark(中國生物HG10426-ACG),pCMV3-hBMP4-OBMP4-OFPSpark(中國生物HG10609-ACR),pCMV3-hBMP7-GFP-GFPSpark(中國生物HG10083-ACG),pCMV3-hWNT1-GFPSpark(中國生物HG10721-ACG),pCDNA3-EGFP(添加基因質粒#13031),pCMV-m櫻桃膜86(Addgene質粒#55779),pCMV-R-GECO187(Addgene質粒#32444),pCMV-mCherry2(Addgene質粒#54517),pCDNA3.1-mSHH-FL,39pCDNA3.1mSHH-FL-EGFP,36pCDNA3.1-mSHH-FL-mCherry2,36pCDNA3.1-V5-DISP重量-HA39(加增基因質粒#126410),pCDNA3.1-V5DISPCS-HA,39pCDNA3.1-V5-DISPΔC-HA, pCDNA3.1-V5-DISP4xAA-HA, pCDNA3.1-V5-DISP重量-Dronpa3-HA, pCDNA3.1-V5-DISPCS- Dronpa3-HA, pCDNA3.1-DISPΔC-Dronpa3-HA.Dronpa3構建物來自Dronpa3-N1(Addgene質粒#54682),并插入到DISP殘基A695和V696之間。Dronpa3PCR(NEB)酶切位點擴增后,用Phusion PCR(NEB)擴增到IC3。AP2/網格蛋白結合突變體DISPΔC和DISP4xAA使用Quik改變誘變技術(Quik Change II XL定點誘變試劑盒,安捷倫,200522)創建。

                  Dronpa3 BsrG1引物:

                  Forward:5' tatagatccACCGGTCtgtacaATGGTGAGTGTGATT 3'

                   

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                  反向: 5‘ tataAGTCGCGGCCGCCTAtgtacaCTTGGCCTGCCT 3”

                  快速更換引物:

                  c端刪除5‘gagccaggctcagccCTCGAGtacccctac 3’

                  DISP1 L1249/1250A引物:

                  前進: 5‘ ccaggctcagccgcggcgcagtcctgtctg 3”

                  反向: 5‘ cagacaggactgcgccgcggctgagcctgg 3”

                  DISP1 L1324/1325A引物:

                  前進: 5‘ caagccgccgagggcgctgcgcaccctgcccag 3”

                  反向: 5‘ ctgggcagggtgcgcagcgccctcggcggcttg 3”

                  DISP1 L1441/1442A引物:

                  前進: 5‘ gtggagccaagcgcggcgcagaccgatgaa 3”

                  反向: 5‘ ttcatcggtctgcgccgcgcttggctccac 3”

                  DISP1 L1516/1517A引物:

                  前進: 5‘ actcagacctgtctggcgagagtgcggcaataaaaacactactcgagtacc 3”

                  反向: 5‘ ggtactcgagtagtgtttttattgccgcactctcgccagacaggtctgagt 3”

                  蛋白質穩定性環己酰亞胺測定法

                  分配Flp-Inmef穩定表達V5-DISP重量-HA或V5-DISPCS-HA瞬時轉染pCDNA3.1-mSHH-FL或空載體對照。轉染后,將細胞復制到60 mm內2組織培養皿,培養過夜。. 將環己酰亞胺(20mg/mL,溶解在DMSO中)加入到所有平板中,用0、2、4、6、8、1倍RIPA緩沖液裂解12小時(Thermo科學)。. 細胞裂解物的蛋白質含量歸一化,用westernblot檢測DISP(大鼠抗ha,1:2000,Roche,11867423001)和裝載對照小鼠抗微管蛋白(1:1微管蛋白10000,CST,DM1A)。使用密度測定法(ImageJ)計算剩余蛋白的比例88的時間點除以0個時間點的密度測量法。

                  免疫印跡法和免疫共沉淀法

                  為了進行蛋白印跡,SDS-PAGE樣品在4-15%三甘氨酸SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)上運行,并使用Tris/甘氨酸/SDS緩沖液(Bio-Rad)轉移到固定p PVDF(微孔)上,1小時。在室溫下,用5%的牛奶和0.1% Tween-20(TBST)或5% BSA inTBST的tris緩沖鹽水封閉膜1小時。抗體稀釋度為抗HA(1:3000;羅氏3F10)、抗V5(1:2000;生命技術SV5-Pk1)、抗SHH(1:2000;CST C9C5)、兔抗驅動蛋白(抗Kif5B,1:5000;Abcam ab167429)和/或微管蛋白(1:10000;CST DM1A),阿爾法適應蛋白(1:1000,熱科學AC1-M11)(1:1000,貝氏生物科學A304-718A)。相應的HRP偶聯二抗(Jackson免疫)孵育1 hrat RT ata 1:5000濃度。紅外抗體(Li-Cor)在雙聯時使用HRP偶聯抗體的1:10000濃度。印跡是通過使用奧德賽Fc(Li-Cor)和ECL Prime(GE)開發的。

                  如Marada等人所述,進行了生物素化分析和隨后的密度測定法。(DOI: 10.1371/journal.pgen.1005473).101簡單地說,活細胞用冷PBS(pH 7.4)洗滌3次,然后在4時輕輕搖晃30分鐘。C在含有0.5 mg/ml EZ-LinkSulfo-nhs-生物素的PBS中(熱科學)。生物素化通過用含有50 mMTris的冷PBS洗滌兩次細胞來猝滅。收集細胞并用RIPA緩沖液裂解。裂解液與50 ml鏈霉親和素瓊脂糖珠(熱科學)一起孵育1小時。C. 然后用RIPA緩沖液洗滌珠子三次,在含有2 mM游離生物素的煮沸樣品緩沖液中提取珠子結合蛋白。用SDS-PAGE和western blot分析上清液和鏈霉親和素珠洗脫后的蛋白。使用斐濟進行密度分析,并測定鏈霉親和素結合的細胞表面與裂解液DISP的信號密度比值。

                  為了進行免疫沉淀,將穩定表達全長SHH的小鼠胚胎成纖維細胞瞬時轉染,表達野生型、CS突變體或ΔC DISP蛋白。然后培養細胞,在修飾的HK緩沖液(20mM HEPES,10 mM氯化鉀;pH 7.9)+ 2.5%甘油+50mM氯化鈉)中分離質膜組分。102蛋白質含量歸一化,膜組分用蛋白A/G Plus瓊脂糖(Santa Cruz SC-2003)預清除,樣品用EZview Red抗HA親和凝膠(E6779-1ML,微孔Sigma)在4C下免疫沉淀1.5小時。然后在室溫下在裂解緩沖液和150 mM氯化鈉中洗滌3 x 5 min,并在室溫下在5X SDS緩沖液中洗脫。采用SDS-PAGE和免疫印跡分析AP2和HA(A(1:101011)、β(1:1000,貝氏生物科學A304-718A)、HA (1:3000,羅氏,3F10)。

                  球體生成與分析

                  使用穩定表達野生型或CS突變型V5-DISP-HA蛋白和強力霉素誘導的SHH的IMCD3細胞生成球狀體(DOI: 10.1038/nprot181)。.2014.51球體固定前24小時,用100ng/mL的強力霉素培養基誘導SHH表達。第二天,球狀體被固定和染色。51對球狀體進行兔抗shh(1:100,Santa Cruz,H-160)、大鼠抗ha(1:250,Roche,3F10)、小鼠抗v5(1:300,生命技術,SV5-Pk1)染色。二抗染色時進行F-actin和DAPI染色(1:1000)。染色后,IMCD3球狀體安裝在熒光計-g(ThermoFisher)中,并在尼康A1R掃描共聚焦顯微鏡上成像。

                   

                  細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e9


                   

                   

                  以0.4 μm的間隔對整個球狀體進行掃描。只有包含明確管腔的球狀體和單層細胞被用于分析。對細胞中心的單個細胞進行分析(DAPI占細胞最大體積)。單個細胞的頂端和基底表面由最大的f-肌動蛋白熒光來定義。HA的DISP定位分布曲線計算為沿基底至頂端細胞膜的強度線曲線。數據歸一化為1,每個條件下分析n= 21-29個細胞,取自多個實驗的3個生物重復。對于頂端超過基礎熒光強度比,測量細胞的頂端和基礎表面的平均強度值(由峰值f-肌動蛋白強度定義),并對每個細胞進行比較。值<1表示主要是基礎蛋白積累,>1表示根尖積累(腔面),每個條件下有n= 40-47個細胞。

                  共定位分析

                  在單個細胞的內吞體區域內分析DISP-HA和單個內吞體標記物之間的共定位。Pearson的相關系數值代表了所分析的內吞體腔室內的DISP的部分,并不代表整個細胞體積。為了進行分析,掃描的細胞體積作為最大強度投影(MIPs)。伊拉斯蒂克90用于內體染色的輸出MIPs,生成突出內體標記物的分割掩膜。然后,mip和掩碼通過細胞分析器中的一個輔助管道運行(DOI: 10.1371/journal。pbio.2005970)89在測量皮爾遜相關系數的同時測量皮爾遜相關系數。輸入圖像包括1)f-肌動蛋白或SHH-mCherry(瞬時轉染mef)輪廓和分段單個細胞在掃描區域,2) DAPI作為參考節點f-肌動蛋白分割和數量細胞每個掃描區域,3) HA測量DISP,4)內吞體標記測量感興趣的內吞體標記,和5)分割面具細化共定位內吞體分析區域標記。對標記物進行分類并輸入管道,根據HA和內體標記物的適當閾值,計算內體室內每個細胞的相關系數。輸出數據中低于曾15百分位的任何f-肌動蛋白標記的細胞區域被排除在數據集中,以避免死亡或細胞部分。在這些實驗中,=60-126對照轉染細胞和=23-39轉染的SHH細胞從3個生物重復中進行了分析。

                  DISP膜內化

                  MDCK cellsexpressing DISP重量-Dronpa3, DISPCS-Dronpa3或DISPΔC-Dronpa3被鍍在Lab-Tek II室載玻片上,并允許其生長,直到它們形成單層。抽吸細胞培養基,用含有10 mM HEPES的無血清培養基替換。細胞用aTCSSP8 STED 3x共聚焦顯微鏡(徠卡)成像,配備enclosureboxheatedto37C,5%CO2for80minutesat2.5-minuteincrementswithz-seriescoveringtheentirecellvolumeofthemonolayer.對DISP-Dronpa3構建物進行成像30分鐘,以監測任何光漂白或光毒性的影響(未檢測到)。在培養基中加入25 μM Pitstop 2(ab120687,abcam,溶解在DMSO中),阻斷內吞作用,導致DISP-Dronpa3在細胞表面上積累30分鐘。隨后,將含有10%胎牛血清的培養基替換Pitstop2治療的無血清培養基,然后每2.5分鐘繼續成像50分鐘,以測量恢復情況。

                  在這個時間過程中,通過ROI沿著相鄰細胞膜的細胞-細胞界面進行標記來測量DISP-Dronpa3構建物的膜積累和隨后的內化率。使用LAS X軟件記錄Dronpa3沿膜的熒光強度。在添加Pitstop 2為1后,將每個ROI的數據歸一化,時間點0的熒光強度歸一化。在Pitstop 2洗脫后,時間點0的熒光強度也被歸一化為1。每個條件下從3個生物重復中分析n=31-57個細胞roi。

                  熒光素酶報告分析

                  分配穩定表達MSCV-Hygro或MSCV Hygro-Shh的mef以5 3 10的密度播種56孔板中的每孔細胞。第二天,將pcDNA3-V5-WT Disp-HA(3 μg)或pcDNA3-V5-CS Disp-HA(3 μg)轉染到Disp中表達載體或Shh的細胞。同時,聚苯乙烯克隆缸(內徑9.5mm的x 6.2 mm高度,科學軟件,Bel-Art)在70%乙醇消毒,在無菌PBS洗滌,干燥,放置在12孔的中心孔板,創建一個障礙的內環和外環之間的井,如前所述。39Shh Light II報告細胞103,104是在1 3 10點播種的嗎5圓柱體外環周圍的細胞。分配轉染了Disp表達載體的穩定細胞以5 3 10的密度接種4圓柱體內環內每口孔的單元。細胞在允許之間恢復。第二天,從細胞中移除培養基,并移除圓柱體,在Shh Light II和Disp之間形成一個無細胞的屏障細胞細胞用PBS洗滌3次,然后用DMEM無血清完全培養基洗滌。每孔中均加入DMEM無血清完全培養基,孵育2小時。每2小時更換一次,共6小時。6小時后,每孔加入1 mL DMEM無血清完全培養基,讓細胞孵育曾36小時。報告基因檢測根據雙熒光素酶報告試劑盒說明(Promega)進行。實驗重復三次,重復三次,所有數據合并。

                  掃描電鏡和定量

                  E9.5胚胎(n=8)固定在2.5%戊二醛、2%多聚甲醛和含2 mM MgCl的0.1 M碳酸鈣緩沖液中2.固定后,將樣本斬首,然后將一根針插入前神經管,將胚胎平分

                   

                  e10細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日


                   

                   


                   

                   

                  矢狀面暴露神經管腔、底板和脊索的內部。解剖樣品用緩沖液洗滌,0.1%四氧化鋨水溶液固定1小時,用ddH洗滌2O,用上升的乙醇系列脫水,臨界點在液體CO中干燥2使用自動采樣931(圖動)。干燥的樣品在15 nm銥的行星旋轉下濺射涂層,并使用埃弗哈特-索恩利和T1探測器在2 kV的熱費舍爾科學透鏡掃描電子顯微鏡下成像。用Ilastik分離延伸和初級纖毛,對神經管腔細胞延伸到初級纖毛接觸進行顯微鏡分析90生成分割掩碼。利用二次手動分割來驗證纖毛。然后將分割掩模輸入到ImageJ中88通過曼德斯系數分析來分配對象計數和測量覆蓋(接觸),每個基因型分析了4到10張顯微照片,共計1784條初級纖毛和39070張延伸(n=344 Disp1. +/+, n=684 Disp1印第安納州/+和n=756 Disp1英德爾初級纖毛)。擴展計數包含的閾值被調整為包含在每個顯微照片中大于纖毛的任何物體。我們通過人工計數一個胚胎上的纖毛接觸(從5張顯微照片中總共有389個初級纖毛),驗證了我們的自動管道的準確性。胚胎自動分析確定53.89%的初級纖毛與細胞延伸接觸,SD為15.44,而人工分析確定52.18%與SD接觸為10.16接觸,表明我們的管道是準確的。

                  連續塊面掃描電鏡

                  E9.5 Disp1+/+, Disp1CS/+, Disp1印第安納州/+, Disp1CS/INDEL, Disp1英德爾, Myo10+/m1J和Myo10m1J/m1J胚胎被固定在2.5%胚胎中戊二醛,2%多聚甲醛在0.1M碳酸氫酸鹽緩沖液中。固定后,樣品在室溫下在2%四氧化鋨碘化緩沖液中固定90分鐘,然后直接轉移到碳酸氫鹽緩沖液中的2.5%亞鐵氰化鉀中。樣品用ddH2O徹底沖洗,40時孵育。C在1%硫脲酰肼中浸泡45分鐘,然后再次徹底清洗,然后在2%四氧化鋨水溶液中室溫孵育90分鐘。樣品用ddH2O沖洗,并在1%的醋酸鈾酰水溶液中孵育過夜。然后C被加熱到50。C30分鐘,在室溫下保持1小時,恢復到50。. 用ddH2O徹底沖洗后,樣品在一系列上升的乙醇中脫水,在環氧丙烷中過渡,并用EMBed-812環氧樹脂滲透。100% EMBed-812中的樣品在60處聚合。C2天。選定的樣品被裁剪、安裝、涂上銥,并安裝在賽默費舍爾科學型體積鏡掃描電鏡中進行成像。成像條件,包括為了緩解電荷的水蒸氣壓力,根據每個樣品進行調整,以確保一致的成像和切割。每個基因型至少有2個胚胎,每個胚胎進行2個個體掃描系列。單個掃描系列由大約500-1000個連續切片組成,組織深度為50-100mm,X,Y分辨率為20-40x20-40nm/像素,連續切片為60-100nm間隔。用Amira(ThermoFisher)生成片段對齊和體積渲染的單個細胞。數據集被上傳到貓女那里72,91用于量化細胞延伸的長度和頻率。膜延伸被分割,并通過整個掃描區域的連續切片進行單獨映射,直到它們的終點或細胞-細胞膜密度超過分辨率,阻止了進一步的延伸映射。從10個連續切片(…1mm深度)的延伸/核值進行定量,以確認膜泡是連續延伸的,每個胚胎分析1mm厚的切片系列。. 5-10

                  量化與統計分析

                  每個實驗中使用的小鼠的數量和發育階段在圖形或圖形圖例中給出。在分析中使用的額外數字(n)包括在方法細節中用于個別實驗。實驗沒有以盲法進行,除了分析……MYO10實驗中的E8.5胚胎,如圖7所示。所有統計分析均采用GraphPad Prism進行。多重比較采用單因素方差分析,以Tukey的多重比較作為后檢驗。兩種條件之間的顯著差異由雙尾學生st檢驗確定。共定位定量采用細胞分析儀進行89或ImageJ(斐濟)88在適當的情況下,用皮爾遜相關系數或曼德的記分系數進行分析。除非另有說明,所有量化數據均以平均± SD表示,p<0.05被認為具有統計學意義。顯著性描述為**<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0。. 0001,ns =不顯著。

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

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                  圖S1。CRISPR-cas9生成的Disp1突變小鼠表現出表型,與圖1相關

                  利用(A) CRISPR-Cas9基因靶向技術,生成了一個在DISP第一個細胞外環中保守的Furin切割位點發生突變的敲除小鼠。基因靶向導致產生所需的等位基因(278RRE到AAA,Disp1CS)和一個11個堿基對的缺失突變體(Disp1英德爾).DISP蛋白的示意圖顯示了Furin裂解位點以及用于生化和細胞生物學分析的V5和HA表位標簽。該基因敲除的小鼠沒有V5或HA表位標簽。指出了DISP甾醇傳感域(SSD)和轉運體基序。

                  (帶C) P35 Disp1CS/CS小鼠表現出可變的腦積水(B0),但與同窩對照動物相比,體型沒有明顯減少。(下頁繼續圖例)

                  (D) P0 Disp1CS/INDEL幼崽比同窩的對照組小鼠要小。

                  (E)與圖1D對應的冠狀面MRI0顯示為Disp1CS/+和顯示器1CS/INDEL老鼠

                  (F)microct生成的男性頭骨的3D渲染CS/+和顯示器1CS/INDEL老鼠顯示。

                  (G) MicroCT線性測量標志,用于分析顱骨沿矢狀面和水平面的MicroCT線性測量標志顯示。

                  (G0)從12個Disp1中計算出的指示地標(L1-L10)的線性測量結果CS/+和10 Disp1CS/INDEL老鼠合并男性和女性的數據,結果顯示為平均± SD。



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                  S2。E9.5對照和Disp1的基因表達分析CS/INDEL突變體胚胎,與圖2相關

                  (A)箱形圖顯示了所示基因型的E9.5/27-29體細胞胚胎的祖細胞結構域的絕對邊界。從FP開始的腹側的位置顯示在每個盒子的底部,而背側的位置顯示在每個盒子的頂部。

                  (A0)顯示了相應的指示基因型E9.5胚胎神經管的平均垂直DV長度。n = 3個胚胎,每個胚胎測量5-8個切片。數據以平均±SD顯著性表示,表示為*p < 0.05,****p < 0.0001,ns =不顯著。.

                  (C帶)Gli1原位雜交的心臟水平切片的E9.5/27-29體細胞胚胎的指示基因型顯示。顯示器1CS/INDEL與對照組相比,神經管對Gli1的誘導作用減少,表明SHH靶基因的激活減少。

                  (D)這是一個原木的火山圖10的p值。Disp1中mRNA表達的對數比倍變化CS/INDEL胚胎與Disp1比較+/+胚胎(每個基因型為n=4)。p值<為0.01和log的基因2比值>為0.5(右上象限)和<為0.5(左上象限)。

                  (下頁繼續圖例)


                  (E)京都基因和基因組百科全書(KEGG)差異表達基因的通路分析。在Disp1中富集的基因集的歸一化富集分數CS/INDEL胚胎與Disp1比較+/+通過基因集合富集分析(GSEA)來確定。黑色為正富集通路,灰色為負富集通路。

                  (F)根據對數尺度上的頂級差異調控基因的熱圖進行排序(每個基因型n=4)。

                  (G)在Disp1中富含差異調控基因的Wiki通路CS/INDEL胚胎與Disp1比較+/+對照與p < 0.05(352個基因)使用richR。

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

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                  圖S3。DISP細胞表面定位和穩定性分析,見圖3和圖4

                  (A)細胞裂解物和(A0)共聚焦顯微鏡觀察穩定表達WT或CS V5-DISP-HA蛋白的IMCD3細胞的球狀體顯示多西土霉素誘導的SHH。(A)橙色箭頭標記已切割的DISP,藍色箭頭標記切割的DISP。a-微管蛋白是加載控制蛋白。(A0) DAPI為藍色,SHH為黃色。

                  (B)細胞表面生物素化進行細胞表面生物素化穩定表達WT和CS V5-DISP-HA蛋白。在鏈霉親和素珠上收集生物素化蛋白,用蛋白印跡法進行分析。

                  采用(C)環己酰亞胺(CHX)處理法檢測DISP的穩定性重量和DISPCS沒有或存在SHH的蛋白質。分別在添加CHX后0、2、4、6、8和12 h采集樣品。western blot檢測DISP-HA和a-Tub蛋白水平。(C0)DISP-HA蛋白的密度定量顯示歸一化為a-Tub。數據顯示為3個生物重復的平均± SD。

                  (D-G)內源性AP2和穩定表達的WT orCS DISP的代表性圖像見DISPmef文件。這些是用于共定位分析的數據集的代表性圖像0.在控制條件下,AP2(品紅)和WT或CSDISP-HA(綠色)顯示中等頻率的共定位(D和E,箭頭)。在表達shh的WT DISP-HA細胞中,HA和AP2的共定位增加,而在CS細胞中沒有增加(F和G,箭頭)。

                  (H-M)內源性內吞標記物和穩定表達的DISP的代表性圖像如圖所示。箭頭指向帶有多個細胞的圖像中表達shh的細胞。

                  (N)在Disp中表達的V5-DISP-HA蛋白的細胞表面生物素化顯示了mef。驅動蛋白是加載控制件。取3個單獨實驗的密度分析的平均值,以確定細胞表面與細胞內DISP蛋白的比例(洗脫:裂解液[HA])。

                  (O) Disp將穩定表達Shh或空載體對照的mef瞬時轉染V5-Disp-HA表達載體,然后與SHH light II報告細胞共培養。熒光素酶報告基因活性歸一化為tk-腎,活性相對于DispMEF空向量控制(設置為1)。重復進行三次檢測,所有數據合并。誤差條表示SD。顯著性由單因素方差分析確定。*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001,ns =不顯著。


                   


                   

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                  S4。在發育中的小鼠神經管中存在長時間的細胞延伸,與圖5相關

                  (A-C)E10.5腹側神經管用抗GFP(綠色)和抗shh(洋紅)免疫染色進行共定位分析,DAPI為藍色,F-actin為紅色。. (A)什+/+腹側神經管在脊索(NC)和FP內具有較強的抗shh信號,而非特異性背景抗GFP信號較低。所有體內定量均采用抗shh信號。(B–B ”0)SHH中SHH和GFP信號的共定位GFP/+胚胎(B)0)插入放大顯示在一個小的f-肌動蛋白陽性管腔延伸的頂端(箭頭)。

                  (C)小提琴圖顯示了抗Shh和抗GFP信號的%信號共定位的小提琴圖+/+, ShhGFP/+, ShhGFP/GFP胚胎切片。點代表從2 Shh中分析的單個部分+/+, 3 ShhGFP/+和3 ShhGFP/GFP晶胚

                  一個矢狀平分的Disp1的(D)掃描電鏡印第安納州/+E9.5胚胎暴露神經管腔(NTL)、FP和鄰近的NC。

                  (E)Disp1的掃描電鏡英德爾NTL從相鄰細胞之間延伸的部分(綠色箭頭)。

                  (下頁繼續圖例)


                                       (FandG)(F)磁盤1的掃描電鏡+/+(G) Disp1英德爾胚胎神經管腔和FP細胞。虛線表示管腔和暴露的FP之間的劃分。在這兩種基因型中,從FP延伸到管腔(綠色箭頭)。連接相鄰FP細胞的長延伸的例子用黑色箭頭表示。黃色箭頭表示沿著延伸處可以看到的凸起。

                  (H)散點圖顯示了所指示基因型的神經管腔內的平均延伸密度。點表示所分析的單個掃描電鏡顯微圖。

                  (I)E9.5/25體scre的三維渲染;Rosa26mT/mG胚胎神經管腔顯示shh標記的細胞素(黃色)來自memgfp標記的FP(綠色)。shh陽性的細胞素顯示與ARL13B(青色)標記的初級纖毛接觸。f-肌動蛋白用洋紅色表示。

                  (I0)顯示了單個細胞素接觸初級纖毛的痕跡。

                  (J)顯示了一個shh陽性細胞素接觸接收細胞初級纖毛的單焦平面。SHH點(J0與arl13b標記的初級纖毛(J00箭84個與初級纖毛接觸的fp衍生延伸物中有39個(46.4%)含有SHH。參見視頻S2。

                  (K–L0)從E9.5 Disp1中提取的單個SBF-SEM切片CS/INDEL(K)和Disp1英德爾(L)胚胎顯示為神經管FP細胞。膜泡顯示在縮放圖像中(K0)和(L0)(用藍色突出顯示)。

                  (M)圖5K和圖5L中的神經管的三維體積渲染顯示了從腹側到背側的角度。A,前,P,后,見視頻S4。. 數據以平均±SD顯著性以**p < 0.01表示,****p < 0.0001表示,ns =不顯著。.


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                  S5。長細胞延伸連接脊索與FP和周圍的間充質,與圖6相關

                  (Aand B)圖6C中所示的脊索的3D渲染圖,顯示了間充質(青色)、脊索細胞(紅色)和整個脊索(灰色)。神經管FP在(B).中顯示為綠色參見視頻S5。

                  (C–C ") E8.5/10 somiteShh-Cre; Rosa26mT/mG脊索(NC)、神經管FP和鄰近的體細胞分別染色為F-actin(洋紅色)、GFP(綠色)、OLIG2(黃色)和DAPI(藍色)。(C0-C”)NC產生的GFP和肌動蛋白陽性延伸(箭頭)沿著FP表面移動,接觸相鄰的體細胞(箭頭)。

                  (D-F)所指示基因型的E9.5胚胎的NC和鄰近FP的F-actin染色顯示。f-actin陽性延伸在所有基因型中都很明顯(箭頭)。

                   

                  (下頁繼續圖例)  


                  (H)小提琴圖顯示了每個掃描步驟中f-actin陽性擴展中自動記錄的SHH斑點的總數(圖6L)。每個基因型分析n=440-796步。數據以帶有1的中位數(實線)表示st 3rd四分位數(虛線)。

                  (I)Shh中抗Shh的點狀脊索向fp延伸的散點圖GFP/+;Disp1印第安納州/+,;Disp1CS/INDEL、和;Disp1英德爾胚胎切片。每個基因型至少2個胚胎,每個基因型4-9個切片,被分析并以非盲的方式人工定量。數據以平均±標準差表示。顯著性為**p < 0.01,****p < 0.0001,ns =不顯著。


                   

                   

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                  S6。肌凝蛋白10有助于細胞素的形成,與圖7相關

                  (A-C)顯示的具有代表性的E9.5胚胎。

                  (D和E)(D)WT和(E) Myo10的單個SBF-SEM切片m1J/m1J神經管FPs與3D覆蓋的貓女追蹤延伸。顏色被任意分配,以提供與單個擴展的對比。參見視頻S6。

                  (F–G0)來自E8.5/10-12體期對照和Disp1的代表性心臟水平神經管切片CS/INDEL對胚胎進行OLIG2(紅色)和DAPI(藍色)染色。顯示器1CS/INDEL胚胎表現出與Myo10相似的OLIG2腹側轉移和丟失的趨勢m1J/m1J胚胎(圖7G)。

                  (H)Segmentedbargraphshowingtheproportionofcardiacleveltissuesectionswithnormal, ventrallyshifted, orabsentOLIG2stainingfromcontrolandDisp1CS/INDEL晶胚每個基因型有n = 3個胚胎,每個胚胎有6-15個切片,共分析27-35個切片。

                  (I)E9.5WT胚胎的3D渲染顯示了用F-actin染色的神經管頂板。f-actin陽性延伸從頂板和背側神經管延伸到管腔(黃色箭頭)。

                  (J)Myo10中的細胞素發生率+/+(淺灰色)或Myo10-/-(深灰色)mef表達指示的熒光標記信號蛋白或GFP對照顯示。數據以平均±標準差表示。以*p < 0.05,**p < 0.01,****p < 0.0001,ns =不顯著。


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                  圖S7。Myo10RNA-seq分析m1J/m1JE8.5/8-10體細胞期胚胎,與圖7相關

                  (A)這是一個火山的原木圖10的價值。日志2Myo10中mRNA表達的比值倍變化m1J/m1J胚胎與Myo10比較+/+胚胎(n = 4為Myo10+/+Myo10m1J/m1J).p<為0.05和log的基因2比值>0.5(右上象限)或<-0.5(左上象限)顯示。對Myo10進行了GSEA檢測m1J/m1J胚胎與Myo10比較+/+.

                  (B)在Myo10中負向富集的生物過程、分子功能和細胞成分的前4個基因本體術語m1J/m1J胚胎代表。

                  (C-E)富含(C)標志、(D)京都基因和基因組百科全書(KEGG)和(E)Myo10生成的Wiki信號通路m1J/m1J胚胎超過Myo10+/+(p < 0.001).Myo10的負富集m1J/m1J刺猬信號圖(C0)來自標志數據庫、軸突引導和Notch信號通路(D0和D00),來自KEGG數據庫和Wnt信號通路(E0),來自Wiki路徑數據庫。

                   

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